COMUNICACIONES LIBRES

Genómica y genética molecular

 

GGM 1
GENOMA MITOCONDRIAL Y METILACIÓN GÉNICA NUCLEAR EN TUMORES MAMARIOS HUMANOS

Cané L.¹, E. Cálcena¹, P. Peltomäki², S.M. Richard¹, A.D. Bolzán¹, W.H. Pavicic^1,2.

¹Instituto Multidisciplinario de Biología Celular (IMBICE), CCT-CONICET-CICPBA, La Plata.
²Department of Medical and Clinical Genetics, University of Helsinki, Helsinki, Finland.
E-mail: wpavicic@imbice.gov.ar

La metilacion de genes nucleares juega un papel importante en la carcinogenesis humana. Varios genes TSGs (tumor suppressor gene) y microARNs poseen en sus promotores islas CpG asociadas a la regulacion epigenetica de su expresion. La variacion del numero de copias (NC) de ADNmt, hallada con frecuencia en varios tipos tumorales, induciria cambios de metilacion en genes nucleares. Mediante los metodos qPCR y MS-MLPA, respectivamente, analizamos ambos eventos en 39 muestras pareadas T/N (Tumoral/No-tumoral adyacente) de pacientes con cancer de mama. Se encontro una disminucion significativa de NC para ADNmt (≅ 30 %, p< 0,01; N>T) en el 74 % de los casos. Comparando Tvs.N obtuvimos: hipermetilacion en microARNs 124a1, 124a2, 124a3, 148a y 152*, hipometilacion en 208a y 373* (p< 0,001), y ningun cambio para 18bl, 1-1 y 200a. Los TSGs APC, CDH13 y RASSF1 presentaron hipermetilacion (p< 0,001). El gen mir-200a dio como resultado una correlacion significativa (p=0,03) entre numero de copias de ADNmt y niveles de metilacion. El gen RASSF1 (p=0,03, r=-0,36) presento una correlacion inversa entre metilacion y copias de ADNmt en tejido tumoral. Podemos decir que la reduccion de ADNmt y la variacion en metilacion de microARNs y TSGs son eventos frecuentes en tejido canceroso mamario. Los resultados nos permiten proponer a la disfuncionalidad mitocondrial -determinada como cambios en su contenido genomico- como un evento celular asociado a los cambios en niveles de metilacion hallados frecuentemente en el desarrollo tumoral del tejido mamario, para el promotor de los genes mir-200a y RASSF1.

GGM 2
ANÁLISIS COMPUTACIONAL DE LA REGIÓN DE HEAT SHOCK PROTEIN-70 (HSP70) EN EL GENOMA BOVINO

Suqueli García M.F.¹, M. Castellote², S. Feingold², P.M. Corva¹.

¹Facultad de Ciencias Agrarias, UNMDP.
²INTA E.E.A. Balcarce.
E-mail: pcorva@mdp.edu.ar

Las proteinas de shock termico de 70 kDa (HSP70) estan muy conservadas en mamiferos, y en bovinos han sido vinculadas al exito reproductivo de las hembras en climas subtropicales. Una busqueda de secuencias de los respectivos genes revelo que en los genomas bovinos de referencia, Btau8 y UMD3.1, esta region de BTA23 tiene errores de ensamblado y la comparacion con el genoma ovino de referencia tomado de Ensembl lo confirma. Se detecto que de los tres genes del cluster, HSPA1A, HSPA1L y HSPA1B solo se encuentran anotados los dos primeros. Tambien hay una diferencia en la secuencia reportada para HSPA1A (GenBank AY149618.1). Las proteinas HSPA1A y HSPA1B solo difieren en un aminoacido y los genes que codifican para dichas proteinas no poseen intrones. La similitud de las regiones codificantes de estos genes podria ser el origen del error, generandose una secuencia hibrida entre ambos que resulta de menor tamano, pues no incluye las cerca de 9 Kb que los separan. Siendo que HSPA1A y HSPA1L comparten la region promotora, esta secuencia erronea involucra los tres genes HSP70. Se propusieron como objetivos de este trabajo generar una secuencia corregida del genoma bovino de referencia de la region comprendida entre los genes NEU1 y LSM2 que flanquean a los genes de interes y mejorar la anotacion de los genes del cluster de HSP70 en BTA 23. Utilizando diferentes herramientas bioinformaticas se genero una secuencia consenso de 52 Kb a partir de clones de una biblioteca genomica de bovino (BAC library CHORI-240) y de genomas bovinos completos recuperados de la division SRA de NCBI.

GGM 3
ANÁLISIS DE CURVAS DE FUSIÓN DE ALTA RESOLUCIÓN (HRM) PARA LA DETECCIÓN RÁPIDA DE VARIANTES DE LOS GENES BRCA1 Y BRCA2

Galeano Petro L.¹, A.C. Abaunza Oviedo¹, G. Guevara Pardo¹.

¹Instituto Colombiano de Genética y Oncología Molecular, Bogotá D.C., Colombia.
E-mail: lilianag7@gmail.com

Las curvas de fusion de alta resolucion (HRM) son un metodo de preseleccion en el escaneo de BRCA1 y BRCA2, que combina simplicidad y rapida identificacion de todos los tipos de alteracion en la estructura del ADN (deleciones, inserciones, sustituciones, cambio en el marco de lectura) y variantes geneticas (mutaciones deletereas, polimorfismos, variantes de significancia desconocida). Analizamos curvas HRM con el objetivo de detectar y diferenciar tipos de alteraciones y variantes geneticas. Se evaluaron los genes BRCA1 y BRCA2 de 100 pacientes colombianas con cancer de mama con diferentes mutaciones deletereas, variantes de significancia desconocida y polimorfismos. El ensayo se realizo con el LightCyclerR 480 Instrumento (Roche). Todas las alteraciones fueron identificadas y diferenciadas por HRM y confirmadas mediante secuenciacion por Sanger. HRM es un metodo valioso para la deteccion rapida de mutaciones deletereas, variantes de significancia desconocida y polimorfismos, con la gran ventaja de poder identificar y diferenciar nuevas variantes en los genes BRCA1 y BRCA2 en los productos de PCR.

GGM 4
ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE PUB16 EN Arabidopsis thaliana BAJO ESTRÉS ABIÓTICO Y SU ROL EN LOS MECANISMOS DE POLINIZACIÓN

Acosta M.G.^1,2, D.M. Mistrorigo^2,4, M.G. Pacheco³, V.H. Casco^1,4.

¹LAMAE, Facultad de Ingeniería, UNER y CITER-CONICET, Entre Ríos, Argentina.
²Laboratorio de Genética, Biotecnología y Mejoramiento Vegetal, INTA EEA Paraná, Entre Ríos, Argentina.
³Laboratorio de Biotecnología, Instituto de Genética Edward A. Favret, INTA Castelar, Buenos Aires.
⁴Facultad de Agronomía, UNER, Entre Ríos, Argentina.
E-mail: acosta.maria@inta.gob.ar

Se ha establecido que en Arabidopsis thaliana un alto porcentaje de las proteinas con dominios U-box (AtPUB) actuan como ligasas de ubiquitina E3 que modifican su patron de expresion genica de acuerdo al estres abiotico aplicado. En el presente trabajo, mediante estudios bioinformaticos se rastrearon en A. thaliana homologos funcionales a ARC1, una proteina PUB de B. napus que participa en el mecanismo de polinizacion, regulando el proceso de aceptacion/rechazo del polen propio. Posteriormente se caracterizo la expresion genica de proteinas AtPUB utilizando estudios moleculares. La secuencia de A. thaliana filogeneticamente mas relacionada con ARC1, aun no caracterizada, resulto ser PUB16. Utilizando real time PCR (qRT-PCR) se analizo la expresion genica tanto en genotipos de A. thaliana salvajes (AtWT) como mutantes (Atpub16), con y sin estres hormonal (giberelina, GA). Se probo que la expresion genica de PUB16 se incrementa significativamente (2,8 veces) en AtWT sometidas a estres hormonal, manteniendose en niveles basales en las plantas mutantes. En paralelo, el bioensayo de polinizacion permitio verificar un aumento significativo de granos de polen unidos a estigmas en plantas AtWT tratadas con GA, respecto a las crecidas en condiciones normales, mientras que las mutantes no exhiben diferencias significativas de adhesiones polen-estigma respecto del control. Estos resultados permiten determinar por primera vez un posible rol biologico de PUB16 en el proceso de polinizacion de A. thaliana, aumentando los contactos polen-estigma frente al agregado de GA.

GGM 5
RELACIONES DE PARENTESCO ENTRE POMELO PARANÁ Y DISTINTAS VARIEDADES CÍTRICAS MEDIANTE EL USO DE MARCADORES MOLECULARES MICROSATÉLITES

Lezcano C.C.¹, B.I. Canteros¹, A.F. Puebla², E.M.S. Moreno³, M.G. Muñoz Hidalgo², V. Nishinakamasu².

¹EEA INTA Bella Vista, Corrientes.
²Instituto de Biotecnología INTA Hurlingham, Buenos Aires.
³Instituto de Botánica del Nordeste, Corrientes.
E-mail: lezcano.cecilia@inta.gob.ar

Pomelo Parana es una variante de Citrus x paradisi. Se desconoce su origen genetico, se considera que es un hibrido natural cuya exacta ubicacion taxonomica respecto a otros pomelos no se ha determinado. La fruta es semejante a pomelo pero difiere de este por su menor contenido de acidez y la alta resistencia a la cancrosis de los citrus (Xanthomonas axonopodis pv. citri). El objetivo fue determinar las posibles relaciones de parentesco entre pomelo Parana y distintas variedades citricas mediante el uso de marcadores microsatelites (SSR). El ADN genomico total fue extraido de hojas jovenes de pomelo Parana, Duncan, Foster, pummelo Chandler, C. grandis x C. paradisi y naranja Valencia. Los amplicones obtenidos se visualizaron en geles de agarosa 2 %. Ademas las amplificaciones fueron analizadas en Fragment Analyzer (FA). Se utilizaron los pares de primers especificos P73, P94, P620, P1223, P1826, CCSM77, CCSM156, CCSM09, CCSM06. Los cromatogramas obtenidos con FA revelan claramente una diferencia en cuanto al patron de bandas de pomelo Parana con respecto a las demas variedades estudiadas. Esto coincide con el patron de bandas obtenido con los geles de agarosa, sin embargo, se observa mayor resolucion en el FA. El analisis de coordenadas principales obtenido a partir de los valores de distancias geneticas (indice de Nei) indica menor distancia entre pomelo Parana y naranja Valencia, mientras que hay mayor distancia entre pomelo Parana y pomelo Duncan, Oro blanco, Chandler y Foster.

GGM 6
ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE GENES DE DETERMINACIÓN DEL SEXO EN Diachasmimorpha longicaudata

Mannino M.C.¹, A.C. Scannapieco^1,3, M. Rivarola^2,3, S. Gonzalez², C.A. Conte¹, M. Farber^2,3, J.L. Cladera¹, S.B. Lanzavecchia¹.

¹IGEAF, INTA, Hurlingham, Buenos Aires, Argentina.
²Instituto de Biotecnología, INTA, Hurlingham, Buenos Aires, Argentina.
³Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, CONICET.
E-mail: mannino.constanza@inta.gob.ar

Diachasmimorpha longicaudata (Hymenoptera: Braconidae) es un insecto controlador biologico de moscas plaga de la fruta. Resulta de interes avanzar en la caracterizacion genetica de esta especie y particularmente en su sistema de determinacion sexual. Los mecanismos de determinacion del sexo en insectos se caracterizan por cascadas de genes altamente variables al inicio y con un bloque central altamente conservado que contiene un regulador binario conocido como tra/fem y al menos un efector conocido como dsx. Una senal primaria desconocida activara una de las dos variantes de la cascada, resultando en un patron regulatorio sexoespecifico. A partir de los resultados del transcriptoma de D. longicaudata se ha logrado obtener una cantidad masiva de informacion de transcriptos de la especie. Se identifico una serie de secuencias que se expresan diferencialmente entre hembras y machos adultos (EdgeR), y se generaron candidatos a estar involucrados en la determinacion del sexo. Se seleccionaron y evaluaron algunos de estos candidatos por medio de RT-qPCR para confirmar las tendencias evidenciadas por transcriptomica. Estos resultados permiten un primer acercamiento a los genes que se encuentran involucrados en la determinacion del sexo de D. longicaudata, generando informacion genomica promisoria para la manipulacion genetica de la proporcion de sexos en la optimizacion de los protocolos de cria artificial de este agente de control biologico.

GGM 7
DIVERSIDAD MITOCONDRIAL EN LLAMAS DE LA PROVINCIA DE CATAMARCA

Daverio M.S.¹, Y. Lorenzo1, F. Rigalt², L. Vidal Rioja¹, F. Di Rocco¹.

¹Instituto Multidisciplinario de Biología Celular (IMBICE), CIC-PBA, CCT-CONICET, La Plata, Buenos Aires.
²EEA INTACatamarca, Catamarca.
E-mail: m.sil.daverio@outlook.com

La cria de llamas (Lama glama) constituye una actividad economica de gran importancia en el noroeste argentino debido a que es una especie poliproductora de carne, cuero y fibra. Generalmente, los rebanos extra-andinos comienzan con unos pocos animales de las provincias de Jujuy y Catamarca. Por ello, el conocimiento de su ancestria asi como de su diversidad genetica es relevante para asegurar su conservacion y uso sustentable. En este trabajo analizamos la diversidad mitocondrial de llamas de Catamarca mediante secuenciacion de 540 pb de la region control del ADN mitocondrial de animales de las localidades de Laguna Blanca (n=25), Corral Blanco (n=11) y Antofagasta de la Sierra (n=9). Los parametros de diversidad genetica se estimaron con DnaSP 4.0 y las relaciones evolutivas entre los haplotipos se analizaron con el programa Network 4.6, incluyendo ademas muestras de camelidos silvestres (n=40). La diversidad haplotipica (Hd=0,886) y nucleotidica (ð=0,023) fueron altas. Se identificaron 13 haplotipos dos de los cuales fueron exclusivos de Laguna Blanca, 2 de Corral Blanco y 1 de Antofagasta de la Sierra. Todas las muestras se distribuyeron en dos clusters bien diferenciados, agrupandose el 64,5 % con los guanacos y el 35,5 % con las vicunas. Los resultados de este estudio muestran que las llamas catamarquenas poseen una alta diversidad mitocondrial, con una contribucion importante del linaje vicuna, producto de la hibridacion con esta especie o probablemente con alpacas.

GGM 8
USO DE MICROSATÉLITES PARA LA IDENTIFICACIÓN DE Brassica napus, B. rapa Y SUS HÍBRIDOS INTERESPECÍFICOS

Torres Carbonell F.¹, A. Presotto^1,2, C. Pandolfo^1,2, M.S. Ureta^1,2, M. Poverene^1,2.

¹Departamento de Agronomía, UNS.
²CERZOSCONICET.
E-mail: francisco.torres@uns.edu.ar

El cultivo de colza (Brassica napus; AACC, n=19) resistente a herbicidas es una tecnologia reciente en nuestro pais y presenta el riesgo de transferencia de esta caracteristica a especies emparentadas. El nabo (B. rapa; AA, n=10) es una maleza que suele ser simpatrica con el cultivo y los cruzamientos entre ambas especies son posibles. Se evaluo la utilidad de cuatro marcadores microsatelites para confirmar hibridos cultivo-silvestre. Se sembraron en macetas bajo invernaculo accesiones de B. napus y B. rapa con y sin tolerancia a imidazolinonas. Se extrajo ADN genomico a partir de hoja y se evaluaron dos marcadores SSRs especificos del genoma A (BRMSOO5 y BRMS033) y dos especificos del genoma C (AP1c5pr y Bn83B1). Se probaron distintas condiciones de PCR y los productos se revelaron en geles de agarosa al 2,5 %. Los patrones de banda mas definidos se obtuvieron con los marcadores BRMS005 y AP1c5pr. El primero presento un producto de amplificacion con dos bandas en B. rapa y una banda de menor peso en B. napus, lo que permitio diferenciar las dos especies. Mientras que el AP1c5pr mostro productos de amplificacion en el cultivo y no se observo amplificacion en B. rapa. Estos marcadores combinados en una PCRmultiplex serian una herramienta muy valiosa para detectar hibridos y evaluar su frecuencia en poblaciones de nabo lindantes a cultivos de colza, especialmente porque en pocas generaciones de retrocruza los hibridos se asemejan a alguno de sus parentales y su deteccion visual no seria posible.

GGM 9
MOSCAS FUMADORAS DE TABACO Y CARDIOPATÍAS. EFECTO DE LA NICOTINA EN LA SOBREVIDA Y LA FUNCIÓN CARDÍACA DE Drosophila melanogaster

Perdomo S.¹, L. Morro¹, A. Villegas¹, R. Fernándes¹, A. Icardi¹, N. Beltrame¹, B. Brugo¹, C.A. Valverde², M. Santalla^1,2, A. Mattiazzi², P. Ferrero^1,2.

¹Biología Celular y Molecular, Departamento de Ciencias Básicas y Experimentales, UNNOBA.
²Centro de Investigaciones Cardiovasculares, UNLP-CONICET.
E-mail: santallamanuela@gmail.com

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster es un excelente modelo para estudiar la accion de genes sobre las adicciones humanas. Aqui proponemos un diseno experimental en el que moscas adultas consumen humo de cigarrillo de manera semejante al modo en que lo hace un fumador para estudiar efectos nocivos del tabaco. Se conoce que los componentes del cigarrillo provocan enfermedad de arteria coronaria, apoptosis de cardiomiocitos, infarto agudo de miocardio y cardiopatias congenitas en pacientes y en otros organismos modelo. Los mecanismos por los cuales los componentes del tabaco inducen cardiomiopatias no se conocen con claridad. Nuestros resultados experimentales indicaron que el humo del cigarrillo incremento la incidencia de mortalidad en moscas adultas cuya sobrevida fue evaluada durante 20 dias. La expectativa maxima de vida se redujo en el grupo de las moscas fumadoras. Ademas, observamos un efecto del tabaco sobre el sistema cardiaco mediado por la nicotina. La administracion de nicotina en agudo aumento la frecuencia cardiaca, aumento el indice de arritmias y modifico la dinamica del calcio intracelular, un componente esencial para la contraccion. Finalmente, la accion de la nicotina sobre el corazon podria estar mediada parcialmente por una cascada tipo beta adrenergica ya que el bloqueante de receptores tipo beta, el atenolol, revirtio la accion de la nicotina sobre la amplitud del transitorio de calcio.

GGM 10
ENDÓFITOS DE SEMILLAS DE TRIGO

Grossi C.E.M.¹, S.M. Díaz Herrera^1,2, M.S. Zawoznik¹, M.D. Groppa^1,2.

¹Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires.
²IQUIFIB-CONICET.
E-mail: cecilia.em.grossi@gmail.com

En el campo las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB) con las que se inoculan diversos cultivos deben competir con las comunidades endofiticas presentes en las semillas de las plantas, las cuales pueden proliferar en el mismo nicho ecologico. Con el fin de investigar a que microorganismo/s tendrian que hacer frente las bacterias inoculadas en plantas de trigo, en este trabajo nos propusimos aislar microorganismos endofitos de las semillas de esta especie vegetal mediante un protocolo dependiente del cultivo. Los aislamientos obtenidos se identificaron a nivel de genero a traves de la secuenciacion del gen 16S del ARNr; la mayoria de ellos correspondieron a Firmicutes, generos Paenibacillus y Bacillus. Solo se aislo un microorganismo Gram negativo, una Enterobacteriacea compatible con el genero Pantoea. Se realizo un arbol filogenetico para observar la relacion evolutiva entre los distintos aislamientos a partir del alineamiento de las secuencias del gen 16S del ARNr. Se realizo tambien un analisis RAPD para discriminar los distintos aislamientos de Paenibacillus. Algunos aislamientos presentaron habilidades para promover el crecimiento vegetal o de biocontroladores, por eso se comenzo a poner a punto un protocolo de transformacion de estas bacterias con proteinas fluorescentes (GFP y eYFP) a traves de conjugacion bi o triparental utilizando Escherichia coli DH5α. ya que contar con aislamientos marcados permitira conocer la dinamica de colonizacion de estos organismos en los diversos tejidos vegetales a lo largo del ciclo de vida de este importante cultivo.

GGM 11
DETERMINACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN BRAF POR TÉCNICAS MOLECULARES EN MUESTRAS DE PUNCIÓN ASPIRACIÓN CON AGUJA FINA (PAAF) DE TIROIDES

Moya C.M.¹, M. Monteros Alvi², M. Nallar Dera³.

¹Sector de Biología Molecular, Programa de Diagnóstico y Tratamiento, Hospital de Endocrinología y Metabolismo "Dr. Arturo Oñativia".
²Sector de Anatomía Patológica, Programa de Diagnóstico y Tratamiento, Hospital de Endocrinología y Metabolismo "Dr. Arturo Oñativia".
³Programa de Cirugía, Hospital de Endocrinología y Metabolismo "Dr. Arturo Oñativia", Salta.
E-mail: cmmoya@yahoo.com

Los carcinomas papilares representan el 80 % de los tumores malignos tiroideos. Las alteraciones genicas de mayor importancia clinica en el cancer papilar de tiroides son las mutaciones en el gen BRAF, de ellas el cambio T1799A (V600E) es la mas frecuente. El 100 % de los nodulos con mutacion BRAF positiva se asocian con cancer y son los de peor pronostico. Los objetivos fueron disenar e implementar un estudio molecular que permita identificar las mutaciones en el gen BRAF en PAAF de tiroides y analizar la frecuencia mutacional en la poblacion estudiada. Se disenaron primers especificos en los exones 11 y 15 del gen BRAF para realizar el screening de las mutaciones mas frecuentes mediante High Resolution Melting (HRM). Se pusieron a punto las condiciones del HRM y se estudiaron 30 PAAF de nodulos tiroideos con diagnosticos Bethesda II, III, IV, V y VI. En paralelo, como control se analizaron las mismas muestras por un kit comercial que detecta las cinco mutaciones mas frecuentes en el codon 600 de BRAF. Ademas, todas las muestras analizadas fueron secuenciadas para confirmar los resultados. Hasta el momento no se detectaron mutaciones en el exon 11. Todos los pacientes positivos presentaron la mutacion V600E y fueron identificadas por ambas tecnicas. La frecuencia mutacional en la muestra analizada es del 25 %. La tecnica disenada es altamente confiable con un 100 % de concordancia con el kit comercial. La frecuencia de mutaciones en BRAF se encuentra dentro del rango descrito en la literatura para riesgo de malignidad en Bethesda II a VI

GGM 12
BASES MOLECULARES DE LAS BARRERAS PRECIGÓTICAS A LA HIBRIDACIÓN EN LAS PAPAS SILVESTRES (Solanum SP.)

Maune J.F.¹, A.C. Pontaroli¹, E.L. Camadro¹.

¹Unidad integrada EEA Balcarce INTA-FCA, UNMdP. CONICET.
E-mail: camadro.elsa@inta.gob.ar

La incompatibilidad cruzada (IC) es la principal barrera interna precigotica a la hibridacion en las papas (Solanum sp.). Su comprension es de importancia para ampliar la base genetica de la papa comun y conservar germoplasma silvestre ex situ. Para esclarecer si en la IC estan involucrados loci genicos distintos al locus S de autoincompatibilidad gametofitica, se realizaron 156 cruzamientos dirigidos entre 172 plantas de 12 introducciones de papas silvestres, seleccionandose combinaciones genotipicas segun la relacion polen-pistilo. Se repitieron las polinizaciones en: (a) una combinacion genotipica con IC; (b) la autofecundacion del progenitor femenino; y (c) cada progenitor en combinaciones compatibles (controles). Se uso la tecnica cDNA-AFLP para identificar genes candidatos en pistilos fijados en N2 liquido (2, 7, 24 y 28 hs post-polinizacion). Se identificaron 27 bandas polimorficas (de 100-150 pb) presentes solo en (a) o (c). Dos de ellas mostraron similitud con el factor de respuesta a auxinas ARF-6 (valor E≤6e-14), cuatro con la proteina mitocondrial MPP-alpha (E≤0,37), una con un retrotransposon (E=1e-4) y otra con una secuencia asociada a la reaccion huesped-patogeno (E=4e-6). ARF-6 y MPP-alpha han sido previamente asociadas con androesterilidad y detencion del crecimiento de tubos polinicos en experimentos de silenciamiento de los respectivos genes en otras Solanaceas. Estos resultados dan sustento a observaciones previas del grupo de investigacion sobre el control multigenico de la IC independiente de la especificidad del locus S.

GGM 13
DETECCIÓN DEL TRANSGÉN GT73 DE RESISTENCIA A GLIFOSATO EN POBLACIONES NATURALES DE Brassica napus Y B. rapa

Pandolfo C.^1,2, A. Presotto^1,2, F. Torres Carbonell¹, S. Ureta^1,2, M. Poverene^1,2, M. Cantamutto³.

¹Departamento de Agronomía, UN del Sur.
²CONICET Bahía Blanca.
³INTA Hilario Ascasubi.
E-mail: cpandolfo@cerzos-conicet.gob.ar

La colza (Brassica napus L., n=19, AACC) es uno de los principales cultivos oleaginosos, ocupando el tercer lugar en la produccion mundial. Actualmente existen variedades transgenicas de colza resistentes a glifosato cultivadas en cinco paises; en Argentina el cultivo de colza transgenica no se encuentra aprobado. El nabo silvestre (B. rapa L., n=10, AA) es una especie invasora de gran cantidad de cultivos en todo el mundo, y puede hibridar con el cultivo de colza. En el sudeste de Buenos Aires se identificaron poblaciones de B. napus y B. rapa resistentes a glifosato. Bajo la hipotesis de que las poblaciones portan el transgen de resistencia a glifosato, se analizo su presencia mediante la deteccion del evento GT73, basada en el Protocol RT73-Community Reference Laboratory for GMO Food and Feeds de la Union Europea. Los primers utilizados amplifican un producto de 108 pb que comprende la region recombinante entre la construccion transgenica y el genoma de la colza. Como control positivo y para identificar la pertenencia taxonomica de las especies se utilizo el marcador microsatelite BRMS005, especifico del genoma A de Brassica. El microsatelite amplifico productos en todos los individuos analizados, y los patrones de bandas permitieron diferenciar B. napus de B. rapa. Todos los individuos de fenotipo resistente amplificaron el fragmento de 108 pb. Este hallazgo concuerda con la hipotesis que los biotipos ferales de B. napus y las poblaciones naturales de B. rapa resistentes a glifosato contienen el transgen correspondiente al evento GT73.

GGM 14
UN MÉTODO RÁPIDO Y SIMPLE PARA DETERMINAR EL SEXO EN PINGüINOS PYGOSCÉLIDOS

Teran E.M.¹, M.A. Juáres², P. Perchivale², G. Lo Coco³, M.V. Cuello¹, L.S. Jurado Medina¹, M. Schwab¹, M. Muzzio¹, M.M. Santos², M.R. Santos¹.

¹Instituto Multidisciplinario de Biología Celular, La Plata, Argentina.
²Instituto Antártico Argentino, CABA, Argentina.
³Museo Argentino de Ciencias Naturales "Bernardino Rivadavia", CABA, Argentina.
E-mail: estermt@outlook.es

La determinacion del sexo en aves es relevante para estudios de ecologia, evolucion y conservacion. Sin embargo, en especies donde no existe dimorfismo sexual, es necesario contar con una prueba de sexado que sea eficiente y a la vez no invasiva. En este sentido, se evaluo una prueba molecular anteriormente aplicada en aves no-ratites que se basa en el analisis de ADN mediante la Reaccion en Cadena de la Polimerasa (PCR). Para ello, se procedio a la extraccion de ADN a partir de muestras de sangre de 287 ejemplares de dos especies de pinguinos (Pygoscelis adeliae y Pygoscelis papua). A traves de esta tecnica molecular y el uso de cebadores especificos, se amplificaron regiones conservadas del gen chd (Chromodomain-helicase-DNA-bindingprotein) que flanquean intrones de diferente longitud presentes en ambos cromosomas sexuales (Z y W). De este modo es posible diferenciar hembras (chd-ZW) de machos (chd-ZZ) mediante la observacion en geles de agarosa de dos fragmentos en aves hembras y solamente uno en machos. Nuestros resultados avalan esta tecnica como un metodo rapido y eficaz para determinar el sexo en pinguinos pygoscelidos.

GGM 15
IDENTIFICACIÓN DE NUEVOS ALELOS DE AUTOINCOMPATIBILIDAD EN PAPAS SILVESTRES (Solanum SECT. PETOTA)

Marcellán O.¹, F. Maune¹, E.L. Camadro^1,2.

¹Unidad Integrada Balcarce (Facultad de Ciencias Agrarias, UNMdP-EEA Balcarce, INTA.
²CONICET.
E-mail: marcellan.olga@inta.gob.ar

La hibridacion entre la papa cultivada y las especies silvestres, fuente de resistencia a estreses bioticos y abioticos, puede estar obstaculizada por barreras precigoticas. A fin de dilucidar las bases geneticas de dichas barreras se inicio un proyecto para identificar genes de incompatibilidad cruzada (IC). Estas especies tambien poseen un sistema de autoincompatibilidad gametofitica (AIG) controlado por el locus S, por el cual una planta diploide rechaza su propio polen o el proveniente de otra planta con el mismo haplotipo S. Las reacciones de incompatibilidad que ocurren en el 1er tercio del estilo pueden deberse tanto a AIG como a IC. Para identificar alelos S-RNase de AIG en 13 genotipos de S. gourlayi (grl), S. spegazzinii (spg) y S. chacoense e hibridos interespecificos involucrados en cruzamientos incompatibles intra- e interespecificos, se amplifico ADN usando oligonucleotidos basados en cuatro regiones conservadas del gen, se secuenciaron los amplicones y se alinearon las secuencias usando Blast. Se identificaron ocho nuevos alelos con secuencias parciales que incluyeron las regiones conservadas 2 y 3, la region hipervariable que es la responsable de la especificidad alelica y el intron que tuvo una longitud similar entre los alelos (82-87 bp). La identidad a nivel de nucleotido vario desde 73 % (entre alelos de un mismo genotipo de spg y de dos genotipos de grl) hasta 98 % (entre los dos genotipos de grl mencionados). Esta caracterizacion permitio seleccionar progenitores que no presentan identidad alelica para la AIG, para el estudio molecular de la IC.

GGM 16
EXPRESIÓN DE GENES DE CITOCROMO P450 EN POBLACIONES DE Triatoma infestans SUSCEPTIBLES Y RESISTENTES A DELTAMETRINA

Grosso C.G.¹, M.J. Blariza¹, B.A. García¹.

¹INICSA (CONICETUNC) y Cátedra de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba.
E-mail: bgarcia@biomed.uncor.edu

Incrementos en la expresion a nivel de la transcripcion de genes de citocromos P450 (CYP450) son frecuentemente considerados responsables de aumentar el metabolismo de insecticidas y parece ser un fenomeno comun en la evolucion del desarrollo de resistencia en insectos. Con el proposito de analizar genes que podrian estar relacionados con la resistencia a insecticidas en Triatoma infestans, se aislaron 3 genes CYP450. A partir de las secuencias de ADN copia (ADNc) de esos genes se disenaron primers especificos y sondas Taqman para la determinacion de su expresion mediante la tecnica de PCR en Tiempo Real. Se determino la dosis letal 50 % (DL50) del principio activo deltametrina con la que se realizo una aplicacion topica en la parte ventral del abdomen de ejemplares de T. infestans provenientes de poblaciones susceptibles y resistentes a deltametrina. Las determinaciones de expresion se llevaron a cabo a partir de ARN total extraido de pooles de cuerpo graso de esos insectos en distintos intervalos de tiempo despues de la aplicacion topica del principio activo insecticida. Los resultados de la determinacion de la expresion a nivel de transcripcion de los tres genes CYP450, revelaron que esa expresion fue inducida por deltametrina en los diferentes sexos y estadios estudiados. Ademas, se detecto sobreexpresion de uno de esos genes en la poblacion que presento el mayor grado de resistencia al insecticida. Los resultados obtenidos apoyarian la hipotesis que postula la participacion de genes CYP450 en el desarrollo de la resistencia a insecticidas piretroides en T. infestans.

GGM 17
IDENTIFICACIÓN DE MARCOS DE LECTURA (ORF) NO PREDECIBLES EN GENOMAS EUCARIOTAS POR MEDIO DE ESPECTROMETRÍA DE MASAS

Biondini E.¹, G. Capriotti¹, J. Celano¹, B. Cieri¹, A. León1, G. Manzelli¹, M. Mattiozzi¹, A. Moroni¹, M. Napoli¹, R. Ramos¹, C. Sala¹, M. Sartor¹, R. Tintorelli¹, J. Torres Gregorio¹, E. Vilardo¹, R. Rivera Pomar^1,2, P. Magjor^1,2.

¹Universidad Nacional del Noroeste de la pcia. de Buenos Aires (UNNOBA).
²Centro de Bioinvestigaciones (CeBio), UNNOBA.
E-mail: moroni.ad@gmail.com

La anotacion de genomas predice genes con bastante exactitud mediante la deteccion de ORF, pero falla en regiones no codificantes, ademas de dejar de lado predicciones de ORF <50 aminoacidos. La espectrometria de masas (MS) permite identificar el proteoma que expresa la informacion genomica. Aqui validamos in silico resultados de MS en tandem obtenidos de embriones de Drosophila melanogaster, Rhodnius prolixus y Tribolium castaneum. Los peptidos fueron extraidos y analizados usando LC/MALDI-TOF-TOF y la herramienta MS/ MS IonsSearch, correlacionando los espectros con secuencias provenientes de bases de datos de las 3 especies. Una busqueda BLASTp de los peptidos que no fueron identificados por MS/MS IonsSearch corroboro la similitud con proteinas previamente anotadas en los genomas. En los casos en que no se correspondieron con ORF anotados, se identifico el ORF por tBLASTn. Luego, con el software Translate se tradujeron secuencias genomicas en las que se identificaron los ORF de los peptidos secuenciados. Por ultimo, se llevo a cabo un BLASTp con el ORF deducido para completar la anotacion. Usando esta metodologia identificamos nuevos ORF no anotados en las tres especies de insectos. Estos resultados novedosos fueron obtenidos durante los trabajos practicos de la asignatura Genomica que se dicta en la carrera de Genetica de la UNNOBA a partir de mediciones experimentales llevadas a cabo como parte de proyectos de investigacion del Centro de Bioinvestigaciones UNNOBA-CIC.

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CHROMOSOMAL ORGANIZATION OF K7355-1 SATELLITE DNA IN Ancistrus SP. (SILURIFORMES: LORICARIIDAE)

Silva K.R.1, S. Mariotto², L. Centofante³, P.P. Parise-Maltempi¹.

¹Programa de Pósgraduação em Ciencias Biológicas (Biología Celular e Molecular), Instituto de Biociencias, UNESP Universidade Estadual Paulista.
²Instituto Federal de Ciencias e Tecnologia do Mato Grosso, Cuiabá, MT, Brasil.
³Instituto de Biociencias, UFMT Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá, MT, Brasil.
E-mail: kethy-rs@hotmail.com

Satellite DNA (satDNAs) are the most dynamic components of eukaryote genome. They are tandem repeats of about 100 to 500 pb, generally with hundreds or thousands of copies. They are commonly located in the pericentromeric and centromeric chromosome regions, and in some cases in heterochromatic regions of sex chromosomes. Nowadays, the genera Ancistrus shows 74 species described and a lot of them are not identified yet. Ancistrus sp. addressed in this work is from Currupira river in Paraguay basin (Mato Grosso) and show a 2n=44 and ZZ/ZW karyotype. The objective of this work was to isolate and characterize satellite DNA sequences in Ancistrus sp. genome. The genome of the species was sequenced through Illumina next-generation sequencing (NSG) that generated 175 clusters identified as a putative satellites, minisatellites and transposons by a software Repeat Explorer. Among them, a sequence of 142 pb named as K7355-1, that showed a characteristic layout of satellite DNA was used as a probe in hybridization in situ experiments. It was observed chromosome signals in centromeric regions of almost all chromosomes. This result contributes to the study of genomic organization of the specie corroborating the fact that centromeric regions, rich in constitutive heterochromatin, show a lot of repetitive sequences. Thus, satellite DNAs may play a role both in controlling of formation or maintenance of heterochromatin or possible expression of particular genes that codified proteins, as well as to demonstrate that the Next Generation Sequence is a useful tool to analyze cytogenomics.

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POLIMORFISMO EN LA SECUENCIA GENÓMICA COMPLETA ENTRE UN CULTIVAR ARGENTINO Y UNA ESPECIE SILVESTRE DE TOMATE (Solanum SPP.)

Cambiaso V.^1,2, J.H. Pereira da Costa^1,2, G.R. Rodríguez^1,2, G.R. Pratta^1,2, L.A. Picardi^1,3, D.M. Francis⁴, R. Zorzoli^1,3.

¹Cátedra de Genética, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Rosario, Santa Fe, Argentina.
²CONICET.
³CIUNR.
⁴Department of Horticulture and Crop Science, Ohio State University, Ohio, USA.
E-mail: vladimir.cambiaso@unr.edu.ar

Actualmente con nuevas tecnicas de secuenciacion y teniendo un genoma de referencia, se han conocido las secuencias de mas de 400 genomas de tomates cultivados y silvestres. El objetivo del trabajo fue analizar el polimorfismo entre la secuencia genomica del cultivar argentino Caimanta (C) de S. lycopersicum y la entrada LA0722 (P) de S. pimpinellifolium. El ADN fue secuenciado con un equipo Illumina HiSeq2500. Se obtuvieron para cada genotipo lecturas apareadas de 101 pares de bases (pb) a partir de ambos extremos de cada molecula de ADN. Los programas Bowtie2, Picard y GATK se utilizaron para alinear ambas secuencias al genoma de referencia, organizar y filtrar las secuencias por su calidad y detectar las variantes geneticas entre ambos genomas. Se utilizo VCFTools para trabajar sobre las listas de polimorfismos encontrados. Se obtuvieron 127.746.858 y 132.442.070 lecturas de fragmentos logrando una profundidad promedio de cobertura de 15,35X y 15,79X para C y P respectivamente. Al comparar los genomas se detectaron 1.081.626 polimorfismos de una sola base (SNP) y 316.430 inserciones/deleciones (INDEL) distribuidos en los 12 cromosomas. El cromosoma mas polimorfico fue el 8 (130.590 SNP y 37.397 INDEL) y el menos polimorfico el cromosoma 3 (44.480 SNP y 14.765 INDEL). Los resultados permitiran construir un mapa saturado con marcadores de ADN desarrollados en base al polimorfismo encontrado y detectar QTLs en poblaciones derivadas del cruzamiento entre C y P. Se concluye que se ha detectado un alto nivel de polimorfismo entre estos dos genotipos para todos los cromosomas.

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BÚSQUEDA DE POLIMOFISMOS MEDIANTE SECUENCIACIÓN MASIVA DE GENES RELACIONADOS AL DESARROLLO REPRODUCTIVO DE TOROS GUZERAT

Lirón J.P.¹, A.M. Loaiza Echeverii², M.E. Fernández¹, M. Drummond², D.E. Goszczynski¹, M.R.J.M. Henry², G. Giovambattista¹, D.A. Andrade de Oliveira².

¹IGEVET-Instituto de Genética Veterinaria (UNLP-CONICET LA PLATA), Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata.
²Escuela de Veterinaria, Universidad Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasil.
E-mail: juanpedroliron@gmail.com

El desarrollo reproductivo esta regulado por factores geneticos y ambientales. Entre los caracteres reproductivos, la pubertad es una caracteristica importante en produccion animal, y en bovinos existe una marcada diferencia en la edad de inicio de la pubertad, dentro y entre razas. Guzerat es una de las principales razas cebuinas criadas en Brasil para produccion de carne. La identificacion de genes y polimorfismos que expliquen la variacion de este caracter permitiria la seleccion temprana de toros precoces, aumentando el progreso genetico en el mejoramiento de esta raza. El objetivo del trabajo fue detectar polimorfismos geneticos en genes relacionados al desarrollo sexual. Para esto, se secuenciaron 730 amplicones correspondientes a regiones codificantes, promotoras y reguladoras 5´UTR y 3´UTR de 127 genes candidatos en 96 animales machos de la raza Guzerat, mediante la tecnologia de secuenciacion de nueva generacion (NGS) utilizando un secuenciador MiSeq (Illumina Inc.). Se filtraron los datos por calidad de secuencia, se alinearon las secuencias al genoma Bos taurus de referencia y se realizo la deteccion y genotipificacion de polimorfismos de tipo SNP e indels. Del total de polimorfismos hallados en los 300.000 pb secuenciados, luego de aplicar el filtro por calidad y MAF>0,05, se obtuvieron 838 SNPs, que corresponden a 1 SNP cada 358 pb, y 375 indels. Estos ultimos corresponden a 1 indel cada 800 bp; sin embargo muchos pueden ser artefactos de la tecnica. Como continuacion de este trabajo, los polimorfismos seran asociados a caracteres reproductivos en la raza estudiada.

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ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA DEL COMPLEJO PRINCIPAL DE HISTOCOMPATIBILIDAD BOVINO MEDIANTE UN ARREGLO DE SNPS

Goszczynski D.E.¹, M.E. Fernández¹, A. Rogberg-Muñoz¹, J.P. Lirón¹, H.F. Morales Durand¹, D.M. Posik¹, M.H. Carino^1, P. Peral García¹, G. Giovambattista¹.

¹IGEVET-Instituto de Genética Veterinaria (UNLP-CONICET LA PLATA), Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata.
E-mail: guillermogiovambattista@gmail.com

El Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) bovino es una region cromosomica de aproximadamente 21.984 Kb que incluye genes que cumplen un rol central en la respuesta inmune, y por lo tanto, en los mecanismos de resistencia/susceptibilidad a enfermedades infecciosas y autoinmunes. Es por esta razon que el estudio de la estructura y variabilidad del MHC (denominado BoLA en bovinos) es de gran interes para las ciencias biologicas. En el presente estudio se analizaron 5.585 SNPs en 185 animales correspondientes a seis razas bovinas mediante la tecnologia Axiom. Se estimaron los valores de callrate, frecuencia promedio del alelo menor (MAF), heterocigosidad esperada (He), bloques de ligamiento (LD) y distancia promedio entre marcadores. Los resultados obtenidos mostraron un valor promedio de callrate de 99,48 (26,50 a 100) para los marcadores utilizados. El valor de MAF resulto de 0,23 (0 a 0,5), resultando en un valor de He de 0,31 (0 a 0,616). El analisis de LD permitio identificar 1.165 bloque de ligamiento con un tamano que vario entre 2 y 29 marcadores, siendo la distancia promedio entre marcadores de 3.937 Kb. Segun lo esperado, estos valores variaron considerablemente cuando las razas se analizaron en forma independiente. Los analisis realizados pusieron en evidencia que los marcadores utilizados presentan suficiente informacion, tanto en razas taurinas como cebuinas, para futuros estudios de variabilidad genetica del BoLA y de asociacion con caracteres sanitarios y de produccion.

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EVALUACIÓN DE MATERIAL DE PARTIDA NECESARIO PARA EXTRACCIÓN DE ADN DE COLEÓPTEROS MEDIANTE UTILIZACIÓN DE KIT COMERCIAL

Moreno Ruiz Holgado M.M.¹, E. Martín^1,2, M. Bonano¹.

¹Facultad de Ciencias Naturales e IML.
²Fundación Miguel Lillo.
E-mail: eduardomartin76@gmail.com

La extraccion y purificacion de acidos nucleicos constituye la primera etapa de la mayoria de los estudios de biologia molecular. Los diferentes protocolos de extraccion buscan optimizar la cantidad y pureza de ADN obtenido, como asi tambien garantizar la eliminacion de inhibidores potenciales que entorpezcan reacciones posteriores de ligacion, clonacion y secuenciacion. Si bien los kits comerciales son eficaces para extraccion de ADN genomico de una amplia variedad de materiales (e.g.: sangre, cultivos celulares, tejido animal, levaduras, etc.), estos generalmente no estan ajustados para la extraccion en invertebrados como ser de tejidos de Coleopteros (e.g.: Astylus atromaculatus y Cycloneda sanguínea). Ademas, la cantidad de tejido de partida sugerido en los kits es de 25 mg (e.g.: animales) y debemos tener en cuenta que un individuo completo de A. atromaculatus pesa 23 mg aprox. El objetivo de nuestro trabajo fue determinar el minimo de tejido necesario para obtener una extraccion de ADN exitosa en Coleopteros con un kit comercial, para lo cual se testearon diferentes cantidades de tejido de partida de las especies mencionadas. La efectividad de la extraccion de ADN se corroboro mediante corrida electroforetica. La cantidad minima de material de partida necesario para una extraccion exitosa fue de 3 mg aprox. Si bien los analisis biologicos que requieren la conservacion de la integridad morfologica del especimen no seran posibles con esta extraccion, podemos concluir que el kit produce extracciones exitosas de ADN en Coleopteros con baja cantidad de material de partida.