ARTÍCULOS ORIGINALES

Asociación entre variabilidad genética y fenotípica con ajuste por autocorrelación espacial en Prosopis

Association between genetic and phenotypic variability with adjustment for spatial autocorrelation in Prosopis

 

Teich I.^1*, Mottura M.², Verga A.², Balzarini M.¹

¹ Estadística y Biometría, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Córdoba. CONICET.
² Instituto de Fisiología y Recursos Genéticos Vegetales (IFRGV). Centro de Investigaciones Agropecuarias (CIAP). Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA).

* Author for correspondence ingridteich@gmail.com

Fecha de recepción: 16/07/2015
Fecha de aceptación de versión final: 22/09/2015

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RESUMEN

Los estudios de asociación entre datos genéticos y fenotípicos permiten detectar interacciones relevantes. En estos análisis es necesario considerar los efectos de la estructura espacial de los datos, la cual es muy común en la naturaleza, particularmente en plantas. Prosopis chilensis y P. flexuosa son dos especies arbóreas de importancia económica y ambiental entre las cuales se produce flujo génico y se originan híbridos fértiles. Para la clasificación de estas especies se utilizan caracteres morfológicos, siendo de interés conocer y cuantificar la asociación entre la variabilidad fenotípica caracterizada mediante las variables usadas en la clasificación taxonómica, y la variabilidad genética. En este trabajo se exploran asociaciones multivariadas entre la variabilidad genética y morfológica de un enjambre híbrido entre P. chilensis y P. flexuosa, considerando la posible autocorrelación espacial en los datos. Para esto se utilizó la caracterización genética (seis marcadores microsatélites) y morfológica (13 caracteres) en 81 individuos adultos ubicados en una parcela de 4.700 m2 en Córdoba, Argentina. Se analizó la estructura espacial de la variabilidad genética y morfológica a escala fina y se asociaron ambas caracterizaciones mediante una aproximación de Mantel basada en la correlación de matrices de distancias y nuevas aproximaciones que incluyen el uso complementario de análisis multivariados y modelos lineales mixtos. Se encontró significativa asociación genotipo-fenotipo, información relevante para el ordenamiento del recurso genético algarrobo. Aún con la débil estructura espacial en los datos, la incorporación de la autocorrelación espacial mejoró la capacidad de detección y modelación de la asociación entre la variabilidad genética y fenotípica observada en el enjambre híbrido.

Palabras clave: Estadística Espacial; Índice de Moran; Correlación Parcial de Mantel; Análisis de Correlaciones Canónicas; Análisis de procrustes generalizado.

ABSTRACT

Association studies that relate phenotypic and genetic information allow the detection of relevant interactions. In these studies it is necessary to consider the effects of spatial structure in the data, which is very common in nature, particularly in plant species. Prosopis chilensis and P. flexuosa are two hardwood arboreal species with environmental and economic importance. Significant gene flow occurs between them with the production of natural and fertile hybrids. Given that morphological characters are used to classify individual trees, it is of interest to explore the association between the phenotypic variables used in the taxonomic classification and genetic variability. In this work, multivariate associations between genetic and morphological variability were explored in a P. chilensis and P. flexuosa hybrid swarm considering the possible spatial autocorrelation. For this purpose the molecular (six polymorphic microsatellite markers) and the morphological (13 traits) characterizations of 81 adult trees in a 4,700 m2 plot in Córdoba, Argentina were used. The spatial structures of genetic and phenotypic variability were analyzed at a fine spatial scale. Both characterizations were associated through a Mantel approach based on the correlation of distance matrixes, as well as with new approaches that include the complementary use of multivariate analysis and mixed linear models. A significant genotype-phenotype association, relevant for the management of Prosopis genetic resources was detected. Even with a weak spatial structure, the inclusion of the spatial autocorrelation in the analyses improved the detection and modeling of the association between the observed genetic and phenotypic variability.

Key words: Spatial Statistics; Moran Index; Partial Mantel Test; Canonical Correlations; Generalized Procrustean Analysis.

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INTRODUCCIÓN

Los estudios de asociación entre datos obtenidos a nivel genético y provenientes de otros niveles de organización permiten detectar interacciones relevantes de los genotipos. El estudio de la asociación de información fenotípica y genotípica se realiza frecuentemente con procedimientos univariados (Brachi et al., 2010; Cockram et al., 2010), considerando cada característica de interés separadamente. Sin embargo, la reemergencia de aproximaciones holísticas y multivariadas en los últimos años ha generado un cambio de perspectiva en la biología (Carrari et al., 2006), probablemente facilitado por importantes avances en el desarrollo de tecnologías e instrumental para la caracterización multidimensional de los distintos niveles de organización. Así, las ciencias “ómicas” como la fenómica y la genómica, tienen en común la búsqueda del estudio integral de los seres vivos, para lo cual las asociaciones de distintos tipos de datos es crucial (Houle et al., 2010). Las técnicas estadísticas del análisis multivariado permiten abordar los estudios de asociación multidimensional entre diferentes tipos de datos (Jombart et al., 2009; Balzarini et al., 2011; Teich et al., 2011). Sin embargo, aún cuando las técnicas multivariadas clásicas permiten operar sobre variables correlacionadas, suponen independencia (no correlación) entre las unidades de análisis. Una cuestión fundamental que debe considerarse en cualquier estudio de asociación es la existencia de estructuras de correlación en los datos. Cuando se lleva a cabo un análisis de asociación sin considerar los efectos de dependencia de los datos, se aumenta el riesgo de detectar asociaciones espurias tanto como el de no detectar asociaciones (Keitt et al., 2002). En la naturaleza es frecuente que la variabilidad genética presente estructuras espaciales, particularmente en especies de plantas (Vekemans y Hardy, 2004). Los datos fenotípicos también pueden estar estructurados espacialmente.
Dos procedimientos multivariados diseñados para cuantificar asociaciones no restringidas espacialmente son el análisis de correlaciones canónicas (Hotelling, 1933) y el análisis denominado Procrustes Generalizado (Gower, 1975). A pesar de que no se trata de técnicas de desarrollo reciente, su aplicación en el contexto de datos biológicos masivos sí lo es (Bramardi et al., 2005). No obstante, estos procedimientos de análisis de asociaciones multivariadas se basan en modelos lineales generales que suponen datos independientes, por lo que podrían producir resultados errados bajo autocorrelación espacial. Entre las aproximaciones para estudiar asociaciones multivariadas con datos estructurados espacialmente, se encuentra la prueba de Mantel Parcial (Smouse et al., 1986). El estadístico de la prueba Mantel Parcial correlaciona la información que existe en dos matrices controlando el sesgo que podrían introducir variaciones de otro conjunto de variables (tercera matriz). Por ejemplo, puede ser usado para correlacionar matrices de diferencias de datos genéticos y datos fenotípicos controlando por una matriz de distancias espaciales entre las unidades de análisis. Algunos autores sugieren que cuando se trabaja con datos correlacionados, las pruebas de Mantel, tanto simple como parcial, podrían producir un exceso de tasa de error tipo I cuya magnitud se incrementa con la intensidad de la autocorrelación espacial (Raufaste y Rousset, 2001; Teich, 2012; Guillot y Rousset, 2013). Otra aproximación al análisis de datos correlacionados espacialmente que se encuentra cada vez más difundida, se basa en el uso de modelos lineales mixtos (MLM) (Littell et al., 2006). Los MLM han permitido integrar conceptos relativos a la estructura de correlaciones de cualquier tipo de datos normales en un marco analítico flexible y unificado. Si bien podrían aplicarse a variables sintéticas de distribución continua, como puede ser una componente principal o una variable canónica, su aplicación en el estudio de asociaciones de tipo multivariado es prácticamente nula.
Las especies del género Prosopis (Mimosoideae) constituyen un recurso natural con características de interés debido a sus adaptaciones para crecer en suelos pobres, donde pocas especies pueden sobrevivir (Pasiecznik et al., 2001). En particular, P. chilensis y P. flexuosa son dos especies arbóreas de importancia económica y ambiental en nuestro país. La ocurrencia de flujo génico entre ambas y la producción de híbridos fértiles en ambientes naturales, aunque disturbados por el hombre, genera fenotipos intermedios que dificultan la determinación taxonómica de las especies y los híbridos (Saidman et al., 2000; Mottura, 2006). Con este fin, Verga (2000) confeccionó una clave basada en taxonomía numérica de caracteres morfológicos de hoja y fruto. Asimismo, se desarrolló un conjunto de marcadores moleculares microsatélites (SSR) específico para estas especies (Mottura et al., 2005). Dado que los caracteres morfológicos presentan alta variabilidad con el ambiente, es de interés conocer y cuantificar la asociación entre la variabilidad fenotípica caracterizada mediante las variables usadas en la clasificación, y la variabilidad genética en una escala espacial fina. Cuando el análisis conjunto de la información genética y morfológica sugiere la existencia de un consenso entre ambas caracterizaciones, y de la existencia de unidades biológicas diferenciadas dentro del complejo de híbridos, los procesos microevolutivos que dieron origen a estas unidades pueden ser estudiados más eficientemente, otorgando valor tanto adaptativo como diagnóstico a los caracteres estudiados. El objetivo de este trabajo es explorar asociaciones multivariadas entre la variabilidad genética y morfológica en un enjambre híbrido de Prosopis sp., evaluando la posible estructuración espacial de la variabilidad.

MATERIALES Y MÉTODOS

Datos
Se utilizó una base de datos correspondiente a la caracterización genética y morfológica de un enjambre híbrido de P. flexuosa y P. chilensis ubicado en una parcela de 4.700 m² en el Parque Provincial y Reserva Forestal Chancaní, en el Oeste de la provincia de Córdoba, Argentina (Mottura, 2006). En dicho trabajo se georreferenciaron bidimensionalmente y caracterizaron 100 individuos adultos mediante 6 SSR y 20 caracteres morfológicos cuanti y cualitativos medidos en 10 hojas y 5 frutos por individuo. Para los fines del presente trabajo se utilizaron sólo aquellos individuos en los cuales los datos faltantes no superaran el 50 % de los marcadores moleculares, resultando en un total de 81 individuos. Asimismo se utilizaron sólo caracteres morfológicos cuantitativos y no redundantes, resultando en 13 variables morfológicas. Los individuos fueron clasificados en P. flexuosa, P. chilensis e híbridos en base a la clasificación propuesta por Verga (2000). Del total de individuos, 8 fueron clasificados como híbridos, 63 como P. flexuosa y 10 como P. chilensis. A continuación se resumen algunas características relevantes de la biología y ecología de las especies de estudio así como la descripción de la caracterización genética y morfológica.

Especies de estudio
Prosopis chilensis (Molina) Stuntz y P. flexuosa DC. pertenecen a la sección Algarrobia del género Prosopis. Ambas son diploides con un número cromosómico 2n= 28. Morfológicamente ambas especies se diferencian principalmente por el tamaño de las pinnas y los foliólulos (más largos en P. chilensis), las espinas y los frutos. La polinización ocurre por medio de insectos, principalmente abejas, y la dispersión de semillas es endozoócora. Ambas especies son nativas de América del Sur y en Argentina el rango de distribución natural de P. chilensis es más restringido que el de P. flexuosa, incluyendo las provincias fitogeográficas del Monte, el Espinal y el Chaco. Particularmente en la región del Chaco Árido ambas especies ocupan nichos ecológicos diferentes, debido a los mayores requerimiento de agua de P. chilensis. Sin embargo existen zonas de contacto entre ambas especies donde se registra la aparición de híbridos, particularmente en lugares disturbados por el hombre. La hibridación es común en la sección Algarrobia del género Prosopis (Hunziker et al., 1986; Saidman, 1990; Vega y Hernández, 2005), en el cual existe una gran similitud genética entre las especies (Bessega et al., 2000; Saidman et al., 2000). Estudios del sistema de apareamiento en el enjambre híbrido indican que el flujo génico entre los grupos es asimétrico y que la hibridación está acompañada por un proceso de introgresión (Mottura, 2006).

Caracteres morfológicos
Se utilizaron 13 caracteres morfológicos cuantitativos de hoja y fruto (Tabla 1), los cuales son utilizados para obtener grupos de individuos con características comunes en un grado de detalle mayor que el alcanzado mediante la sistemática clásica (Verga, 1995; 2000; Verga et al., 2009). Si bien se seleccionaron aquellos caracteres menos redundantes existen altas correlaciones entre los mismos. Por ejemplo y como es de esperar el largo del foliólulo (LF) se encuentra altamente correlacionado con el área del foliólulo (AR), el área total de la hoja (AFOL), el largo de la pinna (LPI) y la relación largo-ancho del foliólulo. El único carácter que no se encuentra correlacionado con ningún otro rasgo es el falcado (FAL).

Tabla 1. Caracteres morfológicos seleccionados y su abreviatura

Caracteres moleculares
Los datos moleculares utilizados corresponden a la caracterización genética realizada mediante seis marcadores SSR (Mo05, Mo07, Mo08, Mo09, Mo13 y Mo16) desarrollados específicamente para P. chilensis (Mottura et al., 2005). Dicha caracterización fue realizada a partir de ADN extraído de material foliar de cada árbol adulto (Mottura, 2006). Debido a que en muchos casos no hubo amplificación se seleccionaron aquellos individuos que fueron caracterizados con al menos cuatro de los seis marcadores. El número total de alelos sobre todos los individuos para los seis marcadores es 68 (Tabla 2). El marcador más polimórfico es Mo16, con 15 alelos. El marcador Mo05 es el único que es más polimórfico en P. chilensis y en los híbridos que en P. flexuosa. El resto de los marcadores son muy polimórficos en P. flexuosa y poco polimórficos para P. chilensis, lo cual probablemente se deba a la diferencia en el número de individuos caracterizados en cada grupo. Sin embargo, existen alelos exclusivos tanto para P. flexuosa como para P. chilensis. Como es de esperar, en los híbridos no se detecta ningún alelo exclusivo. El marcador Mo07 tiene un alelo exclusivo de P. chilensis (209). Respecto a Mo08, todos los alelos se encuentran presentes en P. flexuosa, mientras que P. chilensis presenta 5 de los 10 alelos. El marcador Mo09 presenta cinco alelos muy poco frecuentes (203, 223, 227, 235 y 245) presentes sólo en P. flexuosa y con frecuencias menores a 0,01. En P. chilensis este marcador es muy poco polimórfico (dos alelos), siendo el alelo 209 muy frecuente en éste grupo. En la Tabla 2 puede observarse que la heterocigosidad observada para este marcador es la más alta (Ho= 0,6). Dos alelos del marcador Mo013 (244 y 246) y tres alelos de Mo16 (149, 17 y 173) no se registraron en P. flexuosa.

Tabla 2. Polimorfismo y heterocigosidad de los seis marcadores moleculares en los 81 individuos del enjambre híbrido entre P. flexuosa y P. chilensis.

Análisis estadísticos
Para detectar la estructura espacial de los datos genéticos y morfológicos por separado se utilizaron dos aproximaciones multivariadas: la Prueba de Mantel (Mantel, 1967) y el cálculo del índice de autocorrelación espacial de Moran (Moran, 1950) de las primeras variables sintéticas obtenidas mediante Análisis de Componentes Principales. La prueba de Mantel es una de las herramientas estadísticas más utilizadas para evaluar la significancia estadística de la dependencia entre dos matrices de distancias. Para detectar estructura genética espacial (EGE) se evaluó la correlación entre una matriz de distancias genéticas y una matriz de distancias geográficas, mientras que para detectar estructura fenotípica espacial (EFE) se utilizaron las matrices de distancias morfológicas y de distancias geográficas. En todos los casos se utilizaron las distancias Euclídeas, calculadas sobre la matriz de frecuencias alélicas (distancias genéticas) sobre los datos morfológicos estandarizados (distancias morfológicas) y sobre las coordenadas geográficas (distancias geográficas). La evaluación de la significancia del estadístico de Mantel se realizó mediante valores-p obtenidos por permutación (9999 permutaciones). Los análisis se realizaron con las librerías “bioDist” (Ding et al., 2008) y “vegan” (Oksanen et al., 2011) en R (R Development Core Team, 2011). La segunda aproximación metodológica (Novembre et al., 2008; Teich et al., 2014) consistió en realizar Análisis de Componentes Principales sobre las frecuencias alélicas y sobre las variables morfológicas y luego calcular la autocorrelación espacial de las primeras componentes obtenidas mediante el Índice de Moran utilizando la red de conexión de Gabriel (Gabriel y Sokal, 1969). La primera componente principal de los datos genéticos fue denotada por CP1g mientras que la primera componente principal de los datos morfológicos se denotó como CP1m. Estos análisis se realizaron mediante las librerías de R “adegenet” (Jombart, 2008) y “spdep” (Bivand et al., 2011). A los fines de visualizar la estructura espacial, con las componentes principales cuya autocorrelación espacial resultó estadísticamente significativa, se realizó un mapa sintético de variabilidad mediante interpolación lineal de la variable sintética utilizando el inverso de la distancia de grado 2.
El análisis de asociación entre variabilidad genética y fenotípica se realizó con tres métodos multivariados: (1) Prueba de Mantel entre las matrices de distancias Euclídeas genéticas y morfológicas; (2) Análisis de Correlaciones Canónicas (ACC); y (3) Análisis de Procrustes Generalizado (APG). En las dos primeras aproximaciones la significancia fue evaluada tanto sin considerar la autocorrelación espacial como contemplando correlaciones espaciales. En el caso de la prueba de Mantel, la autocorrelación se contempló incorporando una matriz de distancias espaciales (Prueba de Mantel Parcial) (Smouse et al., 1986). Para evaluar la significancia de la correlación entre un determinado par de variables canónicas se usaron dos MLM alternativos, y según el criterio de Akaike (AIC) se seleccionó el mejor modelo. Los MLM ajustados consideraron a la variable canónica construida con datos morfológicos como variable respuesta y, como variable regresora (dentro de los efectos fijos) a la variable canónica del mismo par, conformada a partir de datos genéticos. La diferencia entre ambos modelos se produjo al momento de especificar la estructura de la matriz de varianza y covarianza de los términos de error aleatorio. En el Modelo 1 la matriz error se supuso no correlacionada. En el Modelo 2 se especificó una matriz de tipo espacial, con decaimiento exponencial de las correlaciones entre datos de la variable canónica según se incrementa la distancia entre árboles. La raíz cuadrada del R2 de este modelo se usó como el coeficiente de correlación canónica entre el par de variables canónicas analizadas y la significancia de la asociación fue evaluada mediante el valor-p de la prueba de hipótesis de la pendiente del MLM ajustado. Los MLM se implementaron mediante la librería “lme4” (Bates et al., 2015) en R a través de la interfaz que ofrece el programa estadístico Info-Gen (Balzarini y Di Rienzo, 2011). Además se estimó la “estructura canónica total”, i.e. las correlaciones simples entre las variables respuestas y las variables canónicas. En el caso del APG, se cuantificó la asociación no necesariamente lineal entre datos genéticos y morfológicos del conjunto total de datos y de cada individuo en particular, de manera de luego comparar el porcentaje de consenso entre P. chilensis, P. flexuosa y los híbridos mediante un test de ANOVA y comparaciones a posteriori según el test de LSD.

RESULTADOS

Análisis de estructura espacial de la variabilidad genética y morfológica
No se detectó EGE en los individuos del enjambre híbrido de Prosopis sp. La Prueba de Mantel entre distancias genéticas y geográficas no resultó significativa (r= -0,014, p= 0,6) y ninguna de las dos primeras variables sintéticas (CP1g y CP2g), que explican el 17 % y el 14 % de la variabilidad, presentó autocorrelación espacial estadísticamente significativa. Sin embargo, la primera componente principal de los datos morfológicos (CP1m), que explica un 54 % de la variabilidad morfológica observada, presentó autocorrelación espacial estadísticamente significativa según el Índice de Moran (I= 0,15, p= 0,02). El coeficiente de correlación de la Prueba de Mantel fue de 0,062, siendo significativo con un nivel de significación del 10 % (p= 0,1). En la Tabla 3 se presentan los índices de autocorrelación de Moran y su significancia para cada una de las variables morfológicas originales y para la primera variable sintética morfológica. Entre las variables morfológicas con mayor autocorrelación espacial se encuentran aquellas que caracterizan el tamaño del foliólulo (LF, AR, API). La distribución espacial de la variabilidad morfológica se puede observar en el mapa sintético realizado con la CP1m (Figura 1) donde también se grafican los individuos según su posición geográfica.

Tabla 3. Autocorrelación espacial de las variables morfológicas y de las primeras componentes principales obtenidas mediante un ACP.

Figura 1. Mapa sintético de la variabilidad morfológica de un enjambre híbrido de Prosopis sp. obtenido mediante la interpolación de la CP1m

Asociación entre datos genéticos y fenotípicos
Cuando se evaluó la asociación entre la variabilidad genética y morfológica a través de la correlación entre matrices de distancias, la incorporación de la información espacial modificó la conclusión respecto a la significancia de la prueba de Mantel. En el caso en que no se incluyó la matriz de distancias geográficas (Prueba de Mantel Simple) la prueba de asociación arrojó un valor-p de 0,056. Sin embargo, al aplicar la Prueba de Mantel Parcial, que incluyó como matriz control a las distancias geográficas, la asociación entre las distancias morfológicas y las distancias genéticas resultó significativa (p= 0,045). El coeficiente de correlación fue de 0,103.
El Análisis de Correlaciones Canónicas también permitió concluir que la variabilidad genética se encuentra asociada a la variabilidad morfológica de los individuos del enjambre híbrido. Todas las correlaciones canónicas resultaron significativas tanto si su evaluación se realizó considerando la autocorrelación espacial en las variables canónicas morfológicas o no. En algunos casos la incorporación de la estructura espacial resultó en una mejora del ajuste logrado según el criterio de AIC. En la Tabla 4 se presentan los valores de los criterios de AIC usados para seleccionar el modelo más apropiado para evaluar la significancia de la correlación canónica con un MLM, en el contexto de posible autocorrelación de la variable respuesta. Todas las correlaciones canónicas resultaron significativas (p<0,0001) y con coeficientes de correlación altos (Tabla 5). Estos resultados confirman una asociación estadísticamente significativa entre la diversidad genética y la morfológica en el enjambre híbrido. Las variables morfológicas que se correlacionan más fuertemente con el primer eje canónico (Eje 1m), son el falcado (FAL), APT y API, las cuales caracterizan la forma del foliólulo, mientras que los alelos 240, 244 y 234 de Mo13 y el alelo 151 de Mo16 son los más correlacionados con el primer eje canónico (Tabla 6). Estas son las variables de mayor contribución en la correlación de la variabilidad genética y fenotípica. En el segundo par de ejes canónicos las variables morfológicas más correlacionadas con la variable sintética son el área y el largo del foliólulo (AR y LF), así como API, mientras que el alelo 151 de Mo16 y el 226 de Mo13 son los más correlacionados con el segundo eje. El consenso entre la caracterización molecular y fenotípica resultó del 67 %. El primer eje del APG resume un 58 % de la variabilidad del consenso y el segundo eje explica un 6 % (Figura 2). P. flexuosa fue el grupo que mostró la menor proporción de consenso entre la caracterización genética y morfológica (0,63) mientras que los híbridos y P. chilensis no se diferenciaron entre sí respecto a la proporción de consenso, con porcentajes de consenso entre ambos tipos de datos mayores al 70 % (Figura 3).

Tabla 4. Criterios Akaike (AIC) y prueba del cociente de verosimilitud (LRT) para modelos de regresión entre pares de variables canónicas (morfológicas y genéticas) con errores independientes y correlacionados espacialmente.

Tabla 5. Coeficientes de correlación canónica y significancia (valor p).

Tabla 6. Coeficientes de Pearson para la correlación entre el primer par de ejes canónicos y los caracteres morfológicos (A) y los 10 alelos más correlacionados (B).

Figura 2. Ordenación de consenso entre la variabilidad genética y morfológica de 81 árboles pertenecientes a un enjambre híbrido de Prosopis chilensis y P. flexuosa. El gráfico sugiere una clara diferenciación entre los individuos de ambas especies y una mayor variabilidad entre los individuos clasificados como híbridos.

Figura 3. Proporción de consenso promedio (±EE) entre los datos genéticos y los datos morfológicos para los individuos de cada grupo. Letras distintas indican diferencias significativas entre las medias de consenso de los grupos morfológicos definidos a priori.

DISCUSIÓN

A pesar de que en especies de plantas la variabilidad genética suele estar estructurada espacialmente (Vekemans y Hardy, 2004), no se detectó EGE en el enjambre híbrido de P. flexuosa y P. chilensis analizado. La alta densidad de individuos (alrededor de 200 árboles/ha) podría ser motivo de la ausencia de estructura espacial de la variabilidad genética. En áreas con altas densidades de árboles, el solapamiento de las áreas de dispersión de semillas puede producir la mezcla de progenies de diferentes individuos. En esos casos se espera que la EGE sea débil (Hamrick et al., 1993; Degen et al., 2001). El estudio espacial de la variabilidad morfológica, en cambio, detectó estructura espacial. La asociación entre la variabilidad genética y morfológica fue detectada por los tres métodos empleados contribuyendo al proceso de diferenciación de unidades de uso y conservación de Algarrobo. A pesar de la débil estructura espacial en los datos, la incorporación de la autocorrelación espacial mejoró la capacidad de detección y modelación de la asociación entre la variabilidad genética y fenotípica observada en el enjambre híbrido. En el caso de la Prueba de Mantel modificó la significancia de la prueba y en el caso del ACC mejoró el ajuste del modelo que relaciona la variabilidad morfológica con la genética, expresadas ambas por variables canónicas.
Existe una larga discusión en la literatura sobre la pertinencia de la aplicación de la Prueba de Mantel Parcial, y en particular cuando ambos conjuntos de datos presentan autocorrelación espacial (Oden y Sokal, 1992; Dutilleul et al., 2000; Raufaste y Rousset, 2001; Castellano y Balletto, 2002; Rousset, 2002; Legendre y Fortin, 2010; Guillot y Rousset, 2013). Claramente esta controversia no está resuelta aún y la Prueba de Mantel Parcial sigue siendo una de las más utilizadas para evaluar asociaciones bajo autocorrelación espacial. En nuestro trabajo la incorporación de la estructura espacial, aunque ésta era débil, permitió detectar asociaciones multivariadas entre datos genéticos y morfológicos que luego fueron confirmadas por el ACC. Otra forma de incluir la información espacial en estudios de asociación con ACC es la utilizada por Sork et al. (2010), donde estudian la asociación entre datos genéticos (microsatélites) y climáticos en bosques del hemisferio norte. Los autores determinaron la contribución de variables geográficas a la construcción de una variable canónica climática particionando la suma de cuadrados total (no debida al error) de la variable canónica en tres componentes: una debida sólo a las coordenadas geográficas, otra sólo a variables climáticas y otra a la colinealidad entre ambas. Es importante notar que el ACC asume correlación del tipo lineal y que otras correlaciones pueden pasar desapercibidas con este análisis. El APG, en cambio, permite detectar asociaciones no necesariamente lineales (Bramardi et al., 2005). La ordenación de consenso de los individuos del enjambre híbrido bajo estudio permitió diferenciar principalmente a P. flexuosa de P. chilensis. Los híbridos, si bien se diferencian morfológicamente tanto de P. flexuosa como de P. chilensis, genéticamente no se pueden diferenciar de P. chilensis, al menos con los seis SSR utilizados en este trabajo (Teich, 2012). Los resultados de Mottura (2006) sugieren que si bien existe un fuerte flujo génico entre los diferentes grupos morfológicos, éste es asimétrico. La baja diferenciación de los híbridos en el espacio de consenso probablemente se deba a las mayores tasas de apareamiento de los mismos con individuos de P. chilensis y por lo tanto a los mayores niveles de introgresión hacia este grupo. Asimismo, nuestros resultados indican que la proporción de consenso entre datos genotípicos y fenotípicos de estos dos grupos es mayor que la observada en P. flexuosa.
La alta asociación detectada entre la variabilidad genética y fenotípica confiere valor taxonómico a los caracteres morfológicos propuestos para clasificación de híbridos de P. flexuosa y P. chilensis. Si bien los tres grupos de algarrobos analizados presentan identidad a nivel morfológico, respecto al consenso entre la información fenotípica y genética sólo se diferencian P. flexuosa y P. chilensis. Los híbridos no se reconocen como una unidad independiente respecto al nivel de asociación fenotipogenotipo, al menos para los marcadores moleculares y los caracteres morfológicos analizados. Respecto a la incorporación de la autocorrelación espacial de los datos en estudios de asociación, concluimos que su omisión puede afectar los resultados de los estudios de asociación entre variabilidad genética y morfológica, aún cuando la estructura espacial en una u otra sea débil.

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