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BAG. Journal of basic and applied genetics

versión On-line ISSN 1852-6233

BAG, J. basic appl. genet. vol.27 no.1 Ciudad Autónoma de Buenos Aires jun. 2016

 

ARTÍCULOS ORIGINALES

Dinámica del daño en el ADN en leucocitos de equinos sangre pura de carrera sometidos a un test de ejercicio estandarizado

Dynamics of DNA damage in leukocytes of thoroughbred equines subjected to a standardized excercise test

 

Muriel M.1, Seoane A.2, Savignone C.3, Palacios A.3, Ferreira V.1, Boffi F.M.4, Picco S.J.2*

1 Servicio de Medicina y Cirugía de Grandes Animales, Hospital Escuela, FCV UNLP. Centro de Fisiología y Fisiopatología del Equino Deportivo, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata.
2 Instituto de Genética Veterinaria (IGEVET), Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata/CONICET, Argentina.
3 Cátedra de Bioquímica, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata.
4 Profesional independiente.
*Corresponding author: spicco@fcv.unlp.edu.ar

Fecha de recepción: 24/12/2015
Fecha de aceptación de versión final: 21/03/2016


RESUMEN

Esta claramente establecido que durante el ejercicio se produce un aumento en la produccion de radicales libres que pueden romper el equilibrio oxido-reductor y causar dano en el ADN. El objetivo del presente trabajo fue establecer la existencia de dano en el ADN en leucocitos circulantes de equinos sometidos a ejercicio sub-maximo mediante el empleo del ensayo cometa. Se usaron cinco equinos sometidos a un test estandarizado de ejercicio, a los que se les extrajeron muestras antes de comenzar el ejercicio, a los 8,5 m/s, a los 15 m/s, y 1 y 30 min post-ejercicio. Simultaneamente se realizo una ergoespirometria continua para determinar el consumo de oxigeno durante el test de ejercicio. La frecuencia de celulas con dano en el ADN fue 0,448, 0,537, 0,617, 0,556 y 0,592 respectivamente, observandose diferencias significativas con respecto a los valores del tiempo basal (p<0,05). Luego las celulas se clasificaron por niveles de dano, observandose incrementos significativos (p<0,05) especialmente a los 15 m/s y 30 min post-ejercicio. Se observo una asociacion significativa entre la frecuencia de celulas con dano en el ADN y el consumo de oxigeno durante el test estandarizado de ejercicio. Estos resultados sugieren que los factores inductores de dano genotoxico se producen mayoritariamente durante el esfuerzo fisico.

Palabras clave: Equinos Sangre Pura de Carrera; Ejercicio; Daño en el ADN.

ABSTRACT

It is well established that during exercising, an increase in the production of free radicals occurs, which can break the oxide-reducing balance of the cell causing DNA damage. The aim of this study was to establish the existence of DNA damage in circulating leukocytes of horses undergoing sub-maximal exercise by using the comet assay. Five horses subjected to a standardized exercise test were used. Samples were extracted before starting the exercise and, then, at 8.5 m/s, at 15 m/s, and 1 and 30 min post-exercise. Simultaneously, oxygen consumption during the exercise test was measured. The frequency of cells with DNA damage was 0.448, 0.537, 0.617, 0.556 and 0.592 respectively, being significant the differences from the baseline values over time (p<0.05). Then, the cells were classified by levels of damage, with significant increases (p<0.05), especially at 15 m/s and 30 min after exercise. A significant association between the frequency of cells with DNA damage and oxygen consumption during standardized exercise test is observed. These results suggest that genotoxic damage inducing factors occur mainly during physical exertion.

Key words: Equine thoroughbred; Exercise; DNA damage.


 

Introducción

Si bien las primeras evidencias que relacionan al ejercicio con el dano oxidativo datan del ano 1978; es en las ultimas tres decadas que se han acumulado abundantes conocimientos que vinculan estos dos hechos. En la actualidad, esta claramente establecido que durante el ejercicio se produce un aumento en la produccion de radicales libres (RL) del oxigeno (ROS, del ingles Reactive Oxygen Species) y del nitrogeno (RNS, del ingles Reactive Nitrogen Species) y que dicho aumento tiene su base en el incremento de ROS y RNS producidos especialmente en el propio musculo en ejercicio (Powers y Jacson, 2008). La produccion de RL puede alcanzar niveles alarmantes durante el ejercicio extremo, rompiendo el equilibrio oxidante/antioxidante y causando dano en moleculas organicas tales como componentes de membrana, proteinas, ADN, etc. En anos recientes numerosos trabajos han reportado la aparicion de dano en el ADN asociado a estres oxidativo y ejercicio en diferentes modelos y tipos de animales (Wierzba et al., 2006; Gandhi y Gunjan, 2009).
La version alcalina de la electroforesis en gel de celulas aisladas, mas conocida como "Ensayo Cometa", es un metodo sensible, confiable y rapido para detectar rupturas de simple y doble cadena en la molecula de ADN asi como sitios labiles al alcali. Con esta tecnica, la cantidad de dano en el ADN esta dada por la cantidad de ADN que migra en el campo electroforetico, en forma proporcional a la cantidad de dano presente (Picco et al., 2001). El objetivo del presente trabajo fue establecer la existencia de dano en el ADN en leucocitos circulantes de equinos sometidos a un test de ejercicio sub-maximo mediante la utilizacion de la electroforesis en gel de celulas aisladas ("Ensayo Cometa").

Materiales y métodos

Animales
Se utilizaron cinco equinos Sangre Pura de Carrera (SPC) con un peso promedio de 440 kg, habituados a realizar entrenamiento en forma continua en cinta ergometrica.

Protocolo de ejercicio
Los animales fueron sometidos a un test de ejercicio estandarizado sobre una cinta ergometrica marca Kagra modelo 2200. El test consto de las siguientes etapas: 1 min a 1,7 m/s, 4 min a 4 m/s, 1 min a 6,5 m/s, 1 min a 8,5 m/s, 1 min a 10,5 m/s, 1 min a 12,5 m/s, 2 min a 15 m/s, 4 min a 4 m/s, y 1 min a 1,7 m/s, respectivamente. Todo el test se desarrollo con una inclinacion del 3%.

Toma de muestras
Se obtuvieron muestras de sangre periferica por puncion de la vena yugular derecha. Para ello se utilizaron Abbocat No 14 y una guia de 1,20 m de longitud recubierta con papel de aluminio para evitar el contacto de la sangre con la luz. Dichos elementos permanecieron colocados y permeables durante todo el test de ejercicio. Las muestras se tomaron con el animal en reposo previo al ejercicio (T0), durante el test de ejercicio a los 8,5 m/s (T1) y 15 m/s (T2), y a 1 minuto (T3) y 30 (T4) minutos pos ejercicio. En cada toma de muestras se extrajeron 2,5 ml de sangre que fueron almacenadas en tubos eppendorf heparinizados. Las muestras se mantuvieron refrigeradas hasta el posterior analisis.

Ensayo Cometa (versión alcalina)
Para la realizacion del ensayo cometa las muestras fueron almacenadas en ambiente oscuro y a 4o C por no mas de 30 minutos. El ensayo se desarrollo de acuerdo con el protocolo descripto por Singh et al. (1988) con pequenas modificaciones. Se mezclaron 15 ml de sangre con 75 ml de agarosa de bajo punto de fusion al 0,5 % (Gibco BRL, NY, USA). Dicha mezcla se coloco sobre un portaobjetos cubierto previamente con agarosa de punto de fusion normal al 0,5 % (Promega, USA) previamente solidificada. Se prepararon dos portaobjetos por animal. Luego de esto, las celulas fueron lisadas en una solucion detergente (100 mM EDTA, 2,5 M NaCl, 10 mM Tris, 1 % Triton X-100 y 10 % DMSO) por al menos una hora antes de la electroforesis. Para la electroforesis los portaobjetos fueron colocados en cubeta horizontal y cubiertos con una solucion alcalina de electroforesis (1mM EDTA, 300mM NaOH, pH > 13) durante 20 minutos. La electroforesis se realizo durante 30 minutos a 25 V y 300 mA (1,25 V/cm). Luego de la electroforesis los portaobjetos fueron enjuagados 3 veces con una solucion buffer de Tris (pH 7,5) durante 5 minutos y finalmente con agua destilada. Una vez secos, los portaobjetos fueron tenidos con una solucion de SYBR Green I 1/1000 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) (Ward y Marples, 2000). El analisis se realizo utilizando un microscopio Olympus BX 40 provisto de una lampara de mercurio de alta presion de 100 W USHIO USH 102 D. El registro de las imagenes se realizo con una camara Sony CCD y las imagenes se grabaron utilizando el software Image Pro Plusa. Se analizaron un total de 200 celulas por punto experimental. Los leucocitos fueron clasificados primariamente en normales (nucleos sin migracion del ADN) y anormales (nucleos con migracion del ADN). Posteriormente se realizo la clasificacion por niveles de dano tomando como criterio a Kobayashi et al. (1995), donde 1 significo ausencia de migracion visible del ADN y 5 represento el maximo nivel de migracion de dano en el ADN.

Ergoespirometría
Los registros ergoespirometricos fueron obtenidos a traves del sistema Cortex Biofisic MetaVet. El equipo se calibra con cada caballo en particular en funcion de las condiciones atmosfericas (temperatura ambiental, presion atmosferica, humedad relativa ambiente, presion de oxigeno ambiental y presion de dioxido de carbono ambiental) donde se va a realizar el test de ejercicio. Una vez calibrado el equipo, se le coloca al equino la mascara provista de sensor de flujo/ volumen, y luego se lo sube a la cinta ergometrica para dar inicio al ejercicio. Este equipo permite medir el consumo de oxigeno (VO2) en ambas condiciones "Body temperature pressure saturated" (BTPS) donde el analisis se realiza en presencia de vapor de agua o en "Standar temperature pressure and dry" (STPD) esto corresponde a una situacion de 0° C de temperatura, presion de 760 mmHg al nivel del mar en condiciones de ausencia de vapor de agua (seco). La informacion fue procesada con el Programa MetaSoft Vet Metabolic StressR.

Análisis de los datos
Las frecuencias de celulas normales y anormales en cada tiempo de muestreo fueron comparadas utilizando el test de Chi cuadrado con correccion de Yates. Los diferentes niveles de dano fueron comparados utilizando el test t de Student's (SSPSR Version 11). Los resultados se expresaron como la media } DS. La asociacion entre la frecuencia de celulas con dano en el ADN y el consumo de oxigeno se estimo mediante el coeficiente de correlacion y valor de R ajustado.

Resultados

La frecuencia de celulas consideradas anormales fue de 0,448; 0,537; 0,617; 0,556 y 0,592 para el T0, T1, T2, T3 y T4, respectivamente. Una vez iniciado el ejercicio los niveles de celulas con dano en el ADN con respecto al T0 aumentaron significativamente en todos los tiempos estudiados (Tabla 1). Tambien fueron significativos los incrementos observados entre T1 y T2 (X2= 12,79; p<0,005), entre T1 y T4 (X2= 5,93; p<0,05) y la reduccion observada entre T2 y T3 (X2= 7,42; p<0,05).

Tabla 1. Comparación de las células anormales (con daño en el ADN) observadas en T0 y en los tiempos T1, T2, T3 y T4 mediante la prueba de Chi cuadrado

La Tabla 2 presenta los resultados obtenidos con el ensayo cometa. El nivel de celulas sin migracion aparente del ADN (Grado 1) fue significativamente menor con respecto al control cuando los animales alcanzaron los 15 m/s (p=0,0035) y los 30 minutos pos ejercicio (p=0,0175). El nivel de celulas con dano leve (Grado 2) se incremento paulatinamente hasta alcanzar los caballos los 15 m/s (T2), momento en el cual el incremento con respecto al T0 fue significativo (p=0,00609). Un segundo incremento significativo de celulas Grado 2 se observo 30 minutos pos ejercicio (T4) (p=0,025). Tambien se observo un incremento significativo entre T3 y T4 (p=0,0466) y una reduccion significativa entre T2 y T3 (p=0,014). Las celulas con dano moderado (Grado 3) alcanzaron sus maximos valores al termino del ejercicio pero estos valores no se diferenciaron significativamente de los obtenidos para el control ni para los otros tiempos. Algo similar ocurrio con las celulas con dano intenso (Grado 4), que alcanzaron sus maximos valores 1 minuto pos ejercicio (T3), aunque dicho valor no fue significativamente diferente. El porcentaje de celulas con maximo nivel de dano (Grado 5) crecio constantemente desde que los equinos iniciaron el ejercicio, alcanzando los maximos valores a los 15 m/s (p=0,0267) y 1 minuto pos ejercicio (p=0,00025). Tambien se observaron diferencias por incrementos entre los valores obtenidos entre T1 y T2 (p=0,0457) y entre T1 y T3 (p=0,0006) y por reduccion de los valores entre T3 y T4 (p=0,0017).

Tabla 2. Clasificación de las células en niveles de daño en el ADN (ensayo cometa), según Kobayashi et al. (1995). Valores medios expresados en porcentaje (±DS).

El consumo de O2 experimento un crecimiento sostenido desde el reposo hasta que los animales alcanzaron la velocidad de 15 m/s, momento en el cual el consumo de O2 fue unas 10 veces superior a los iniciales. Luego de esto, se produjo un marcado descenso, alcanzando valores similares al basal luego del ejercicio (Tabla 3). La Figura 1 muestra el comportamiento del consumo de oxigeno durante el test de ejercicio y el porcentaje de celulas con dano en el ADN. La asociacion entre la frecuencia de celulas con dano en el ADN y el consumo de oxigeno durante el set de ejercicio fue de 0,88 (R2=0,77), mientras que cuando se agrego la determinacion 30 minutos pos ejercicio la correlacion se redujo a 0,58 (R2=0,342).

Tabla 3. Valor medio de consumo de O2 (± DS) en los equinos SPC sometidos al test de ejercicio.

Letras diferentes corresponden a diferencias estadisticamente significativas (p< 0,05).


Figura 1. Valor medio de consumo de O2 (l/min) y porcentaje de células con daño (CCD) en el ADN durante las cinco etapas del test de ejercicio.
T0: reposo, T1: 8,5 m/s, T2: 15 m/s, T3: 1 min post-ejercicio, T4: 30 min post-ejercicio. % o l/min

Discusión

La produccion de dano en el ADN asociado a ejercicio no es en si un hecho inedito. Existen numerosas publicaciones previas en las cuales animales o humanos sometidos a diferentes niveles de ejercicio expresaron dano en el ADN, muchos de ellos incluso, utilizando la misma metodologia que la empleada en el presente trabajo (ensayo cometa). Sin embargo, el denominador comun de estos trabajos fue la estimacion del dano posterior al ejercicio y no durante el ejercicio (Hartmann et al., 1995; Niess et al., 1996; 1998). Con la excepcion de los resultados obtenidos por Mastaloudis et al. (2004) quienes trabajando en humanos sometidos a ejercicio de resistencia registraron un incremento de los niveles de dano en el ADN a mitad del test (carrera de 50 km), y su posterior retorno a niveles basales 2 hs pos ejercicio, este es el primer trabajo que presenta una cinetica de dano en el ADN producto de un modelo particular de ejercicio estandarizado sub-maximo.
Los resultados obtenidos permiten observar que el ejercicio, bajo las condiciones planteadas en el presente ensayo, produce un incremento en el nivel de dano en el ADN de leucocitos de sangre periferica, alcanzando su maxima expresion al momento de llegar los equinos a la maxima velocidad (15 m/s) y luego, al finalizar la prueba, 30 minutos pos ejercicio. El hecho de que en el momento en que se produce el ejercicio se haya observado la mayor frecuencia de celulas con migracion del ADN demuestra que los factores inductores de dano genotoxico se producen mayoritariamente durante el esfuerzo fisico. Dado que al momento de terminar el ejercicio los valores de dano son significativamente menores a los observados a 15 m/s, puede sugerirse que en ese lapso hay una intensa reparacion del dano que tiene como consecuencia una marcada reduccion del dano en el material genetico. Estudios realizados en 1984 por Van Zeeland en celulas de mamiferos demostraron que, tras inducir dano con rayos x e g, la eficacia de la reparacion permite a las celulas recomponer el 80 % de las lesiones en la molecula de ADN entre 5 y 10 minutos post exposicion, mientras que el 20 % restante se repara pocas horas despues. Estos hallazgos son concordantes con lo observado en el presente trabajo ya que entre la aparicion del maximo nivel de dano y la reduccion significativa del mismo transcurrieron 6 minutos. Si este razonamiento es correcto, debemos asumir entonces que una segunda fuente de dano genotoxico genera el posterior aumento significativo del dano en el ADN observado 30 minutos pos ejercicio. Los mecanismos propuestos para explicar la aparicion de dano en el ADN tras el ejercicio extremo incluyen la produccion de ROS a partir de la cadena transportadora de electrones mitocondrial, el proceso de isquemiareperfusion, reacciones catalizadas por la Xantina Oxidasa, mecanismos inflamatorios y produccion de catecolaminas (Hartmann y Niess, 1999). La cadena transportadora de electrones mitocondrial es posiblemente la principal responsable del pico de dano observado durante el ejercicio maximo. Esto se debe a que durante el mismo, el consumo de oxigeno (O2) se incrementa mas de 10 veces, pero a nivel de la fibra muscular lo hace unas 100 veces, con el consiguiente aumento proporcional de la actividad de la cadena respiratoria y de la produccion de anion superoxido (O2-) (Gandhi y Gunjan, 2009), el cual tiene amplia capacidad de difusion a traves de las membranas plasmaticas (Picco, 2004).
Tras el ejercicio, la produccion de O2- por accion de la cadena respiratoria disminuye pero se activan otros mecanismos capaces de generar estres oxidativo, como la isquemia-reperfusion, la cual es proporcional al esfuerzo realizado y que culmina con la reoxigenacion de las areas isquemicas y la consiguiente produccion de ROS (Adams y Best, 2002). En tal sentido, los resultados obtenidos al comparar el consumo de O2 con la frecuencia de celulas con dano parecen abonar la teoria de la generacion de dano a partir de diferentes estimulos segun sea ejercicio extremo o pos ejercicio ya que el pico de dano 30 minutos pos ejercicio se produce en presencia de bajos valores de consumo de O2. Es probable que tras el ejercicio adquieran mas relevancia factores tales como mediadores inflamatorios, liberacion de RL por leucocitos y el fenomeno de isquemia-reperfusion. Este ultimo probablemente tambien genere dano en el ADN por la via de la produccion de ROS, aunque el origen de estos ultimos sea diferente. Es por ello que futuros estudios seran necesarios para dilucidar la responsabilidad de cada uno de los factores generadores de dano durante el ejercicio en equinos SPC bajo modelos de ejercicio como el planteado en el presente trabajo.

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