COMUNICACIONES LIBRES

Genómica y genética molecular

 

GGM 1
BÚSQUEDA DE DELECIONES GRANDES EN REGIONES DEL PLASTOMA CON REPETICIONES DIRECTAS EN PLÁNTULAS PORTADORAS DEL MUTADOR DE CLOROPLASTOS DE LA CEBADA

Lencina F.^1,2, V. Brizuela¹, A. Landau¹, M.E. Petterson¹, M.G. Pacheco¹, K. Kobayashi², A. Prina¹.

¹ Instituto de Genética "E.A. Favret", CICVyA, CNIA, INTA Castelar;
² Laboratorio de Agrobiotecnología, IBBEA-CONICET-FBMC-UBA, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires (UBA).
E-mail: lencina.franco@inta.gob.ar

Entre los cambios moleculares en el ADN del plastoma producidos por el genotipo mutador de cloroplastos de la cebada (cpm) identificados mediante TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes), se observaron 3 casos de deleciones grandes de 45, 79 y 620 pb, que se ubicaron entre secuencias de repeticiones directas. La causa de las deleciones seria la recombinacion entre estas dos repeticiones. El objetivo de este trabajo fue determinar si este mecanismo de recombinacion podria estar actuando en otras regiones del plastoma que presentan repeticiones directas. Mediante el software REPuter se buscaron en el plastoma de cebada las regiones que contienen repeticiones directas de entre 20 y 40 pb de longitud y separadas por una distancia de hasta 200 pb. Se analizaron dos regiones con estas caracteristicas: una contenida en el gen rpoC2 que codifica a la subunidad beta de la ARN polimerasa y la otra que contiene al gen trnfM del ARN de transferencia tRNA-Met. Se disenaron cebadores para amplificar estas regiones por PCR y analizar la existencia de deleciones grandes mediante la digestion con Celery Juice Extract (CJE) segun el protocolo de TILLING. Esto se realizo en 304 plantulas de cebada cpm que atravesaron muchas generaciones bajo el accionar del mutador. No se identificaron deleciones grandes en ninguna de las dos regiones analizadas. Sin embargo, se identifico una sustitucion A1899G en el gen rpoC2. Se concluye que el mutador no produjo la recombinacion de las repeticiones directas ubicadas en las regiones rpoC2 y trnfM en las plantulas analizadas.

GGM 2
SECUENCIACIÓN MASIVA DE AMPLICONES DEL PLASTOMA DE MUTANTES AISLADAS A PARTIR DE PLANTAS PORTADORAS DEL MUTADOR DE CLOROPLASTOS DE CEBADA

Landau A.M.¹, F. Lencina¹, M.E. Petterson¹, V. Brizuela¹, M.G. Pacheco¹, A.R. Prina¹.

¹ Instituto de Genética "Ewald A. Favret", CICVyA, CNIA, INTA.
E-mail: landau.alejandra@inta.gob.ar

El mutador de cloroplastos de cebada (cpm) es un mutante de un gen nuclear cuya deficiencia origina cambios moleculares en el plastoma. Anteriormente, por la tecnica de TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes) dirigida al plastoma de plantulas cpm se hallaron numerosos polimorfismos originados en al menos 61 eventos mutacionales. Los cambios encontrados hasta el momento, tanto por genetica directa como reversa, indican que el cpm produce mayormente sustituciones y pequenos indels. Ademas, se observo que incrementa la tasa de recombinacion entre segmentos heterologos. En este trabajo, se puso a punto la tecnica de Long PCR para amplificar el plastoma completo de cebada y realizar una secuenciacion masiva de amplicones. Ello se hizo sobre mutantes aisladas por sus fenotipos a partir de plantas cpm y luego estabilizadas por cruzamiento librandolas del mutador. Para ello, se disenaron 14 amplicones de un tamano de entre 7 y 14 kb. Se logro amplificar y secuenciar mediante la tecnologia Illumina los plastomas de seis mutantes. El analisis bioinformatico de las secuencias realizado hasta ahora revelo que la mutante LC13, caracterizada por presentar bandas horizontales deficientes en clorofila, porta dos mutaciones, cada una afectando un gen diferente del complejo ATP sintasa, componente del aparato fotosintetico. Estas mutaciones explicarian el fenotipo observado. El conocimiento de la secuencia completa del plastoma y la identificacion de los polimorfismos presentes en plantas cpm nos permitira una mejor estimacion de la relacion fenotipo/ genotipo en cada mutante.

GGM 3
OBTENCIÓN DEL TRANSCRIPTO Y PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA Y TERCIARIA DE LA ENZIMA HST DE Ilex paraguarienses

Sanchez D.M.¹, D.A. Marti¹.

¹ Laboratorio de Genética Evolutiva, Instituto de Biología Subtropical, Nodo Posadas, CONICET, FCEQyN, UNaM.
E-mail: sanchez_denisse@hotmail.com

La yerba mate representa una parte importante en la dieta en nuestra region, es considerada una fuente de antioxidantes originados por la via de los fenilpropanoides. La enzima shikimato O-hydroxycinnamoyl transferase (HST) esta involucrada en dicha biosintesis catalizando la reaccion: 4-coumaroyl-CoA + shikimate ⬄ CoA + 4-coumaroylshikimate. Las estructuras tridimensionales de proteinas (3D) proporcionan informacion valiosa sobre las bases moleculares de su funcion, permitiendo un diseno eficaz de experimentos, tales como mutagenesis dirigida, estudios de mutaciones relacionadas con enfermedades o el diseno basado en estructura de inhibidores especificos. Con el objetivo de obtener la estructura molecular 3D de la enzima HST, realizamos una busqueda blast de dicha enzima en nuestra base de datos anotada del transciptoma de Ilex, utilizando como templado la correspondiente ortologa de Arabidopsis thaliana. A partir de dicho blast, seleccionamos un hit de Ilex para la enzima segun su longitud, identidad y E-value. Luego con este paralogo de Ilex utilizamos el software Chimera minando en la base de datos PDB y tomando el modelo completo de mayor resolucion e identidad. Resulto que la enzima HST de Ilex presenta 64,17% de identidad en el alineado contra HST de Solenostemon scutellarioides (UniProtKB: E8ZAP2, PDB: 5KJV_A). El modelo por homologia con 5KJV_A seleccionado supero las validaciones de calidad en Ramachandran plot con 96,6% de los residuos en las zonas favorecidas, Verify3D con todos los valores sobre cero y en Qmean.

GGM 4
UNA POSIBLE RUTA METABÓLICA DEL ÁCIDO CAFEOILQUÍNICO EN Ilex paraguariensis A. ST. HILAIRE

Sanchez D.M.^1,2,3, E. Sosa^1,4, G. Burguener⁴, C. Modenutti^1,4, A. Turjanski^1,4, D.A. Marti^1,3.

¹ Consejo Nacional de Investigaciones, Científicas y Técnicas (CONICET);
² Comité Ejecutivo de Desarrollo e Innovación Tecnológica (CEDIT);
³ Instituto de Biología Subtropical, Laboratorio de Genética Evolutiva, Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales, UNaM;
⁴ IQUIBICEN, BIA, UBA.
E-mail: sanchez_denisse@hotmail.com

La yerba mate es preparada a partir de Ilex paraguariensis A. St. Hilaire. El acido clorogenico (CGA) es el compuesto fenolico mas importante de su extracto. Posee propiedades beneficiosas para la salud, siendo anti-oxidante, anti-inflamatorio, antilipemico, entre otras; y es precursor de la sintesis de Oseltamivir (Tamiflu® Roche). Con el fin de analizar los genes de la via metabolica del CGA y genes relacionados, utilizamos la base de datos KEGG y seleccionamos cinco enzimas candidatas que estarian involucradas en el metabolismo del CGA en I. paraguariensis, estas son: PAL, EC: 4.3.1.24; 4CL, EC: 6.2.1.12; CYP73A, EC: 1.14.13.11; HCT, EC: 2.3.1.133 y CYP98A, EC: 1.14.13.36. Realizamos una busqueda blast de dichas enzimas en el transcriptoma de I. paraguariensis partiendo de las correspondientes ortologas de Arabidopsis thaliana. A partir de dicho blast seleccionamos un hit de Ilex para cada enzima segun su largo, identidad (Id) y E-value. Luego con cada uno de estos hits, se realizo una busqueda blast contra enzimas curadas de la base de datos Uniprot: PAL, Id: 63.1 contra P26600; 4CL, Id: 82.1 contra O24146; CYP73A, Id: 92.2 contra Q43054; HCT, Id: 85.3 contra Q8GSM7; CYP98A, Id: 78.1 contra O48922. Finalmente, realizamos un analisis comparativo entre las secuencias de aminoacidos, obteniendo una aproximacion de las relaciones evolutivas con especies modelo, no emparentadas. En el presente trabajo mostramos por primera vez la via completa del CGA en Ilex paraguariensis y la estructura de las enzimas involucradas.

GGM 5
EFECTO DE LA HIBRIDACIÓN EN LA ORGANIZACIÓN DE LOS GENOMAS EN HÍBRIDOS DEL GÉNERO Arachis

Paredes E.N.^1,2, A. García^1,2, V.G. Solis Neffa^1,2, G.A. Robledo Dobladez^1,2.

¹ Instituto de Botánica del Nordeste (UNNECONICET);
² Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura, UNNE.
E-mail: esnaparedes@gmail.com

La hibridacion es uno de los procesos mas comunes en la evolucion genomica de plantas superiores, y uno de los que tiene efectos inmediatos sobre la organizacion de los genomas. Sin embargo, la magnitud de estos cambios aun permanece poco estudiada. En este trabajo a fin de evaluar el grado de diferenciacion genomica que ocurre en respuesta a la hibridacion, se analizaron los cambios en los perfiles de AFLP de 4 hibridos intergenomicos (2 hibridos A. duranensis [genoma A] x A. ipaënsis [genoma B] mas 2 hibridos reciprocos) y 4 hibridos intragenomicos (2 hibridos A. williamsi [genoma B] x A. ipaënsis [genoma B] mas 2 hibridos reciprocos) en relacion a sus parentales diploides. Los resultados demostraron que durante los procesos de hibridacion la perdida de loci de los parentales fue mayor que la ganancia de nuevos loci. El porcentaje de los loci perdidos vario entre los hibridos. En los cruzamientos intragenomicos hubo una mayor perdida de loci del progenitor masculino, mientras que en los intergenomicos hay una mayor perdida de loci del progenitor femenino. Muchos de los loci perdidos de un progenitor se compartieron entre los hibridos de un mismo cruzamiento, y en menor numero entre los de cruzamientos reciprocos. Por el contrario, la proporcion de loci ganados fue similar entre hibridos intra- e intergenomicos, y por lo general estos loci no fueron compartidos entre los hibridos de un mismo cruzamiento, ni entre hibridos de cruzamientos reciprocos. Asi, la hibridacion tendria un efecto selectivo en la perdida de loci de los parentales, mientras que la ganancia es al azar.

GGM 6
CAMBIOS EN LA REGULACIÓN POR PEQUEÑOS ARNS (SRNAS) ASOCIADOS A LA ALOPOLIPLOIDIZACIÓN EN PAPA

Cara N.¹, D. Zavallo², C.F. Marfil¹, S. Asurmendi², R.W. Masuelli¹.

¹ Instituto de Biología Agrícola de Mendoza (IBAM), Facultad de Ciencias Agrarias, U.N.Cuyo, Mendoza. CONICET;
² Instituto de Biotecnología, Centro de Investigaciones en Ciencias Veterinarias y Agronómicas CICVyA-INTA.
E-mail: ncara@fca.uncu.edu.ar

Las variaciones fenotipicas causadas por la hibridacion y la poliploidizacion poseen el potencial de mejorar la productividad y la eficiencia agricola. La papa cultivada cuenta con mas de 200 especies silvestres emparentadas (Solanum seccion Petota), que podrian ser utiles para el mejoramiento genetico. En estos programas historicamente se ha tenido en cuenta solo la introduccion de genes de interes de especies silvestres a la cultivada, pero el efecto que pudiera producir la hibridacion interespecifica y posterior duplicacion cromosomica en la regulacion del genoma ha sido desestimado. Se sabe que la reunion de dos genomas divergentes en un nucleo comun alopoliploide induce cambios epigeneticos como la acumulacion de RNAs pequenos (sRNAs). El objetivo general del trabajo es evaluar los efectos que tiene la alopoliploidizacion sobre el fenotipo, la organizacion y expresion del genoma en papa. Para eso, se obtuvieron lineas alotetraploides duplicando el genoma de un hibrido diploide S. tuberosum x S. kurtzianum por tratamiento in vitro con colchicina. Se analizaron los perfiles de acumulacion de sRNAs comparativos entre el hibrido diploide y lineas alotetraploides mediante sRNA-seq. Se encontraron sRNAs, cuya secuencia target se encontraba en el cuerpo y/o region promotora de secuencias codificantes, y que mostraron una acumulacion diferencial entre el diploide y el tetraploide. De estos genes, se eligieron aquellos con funciones probables relacionadas principalmente con fotosintesis, respiracion y modificaciones epigeneticas y se cuantifico su nivel de expresion por qPCR.

GGM 7
VARIABILIDAD EPIGENÉTICA Y PLASTICIDAD FENOTÍPICA EN Solanum kurtzianum EN JARDINES EXPERIMENTALES

Ibañez V.N.¹, R.W. Masuelli¹, C.F. Marfil¹.

¹ Laboratorio de Biología Molecular, Instituto de Biología Agrícola de Mendoza (IBAM), Facultad de Ciencias Agrarias, UNCuyo, Mendoza. CONICET.
E-mail: veronicanoeibanez@gmail.com

Las especies silvestres de papa tienen una extensa distribucion geografica y una amplia variabilidad fenotipica, aunque poco se sabe sobre los mecanismos que operan en las respuestas a las fluctuaciones ambientales. Se sugiere que mecanismos epigeneticos participarian en la generacion de variabilidad fenotipica posibilitando la aclimatacion y adaptacion de las plantas a diversos retos ambientales. Se cultivaron durante tres anos clones de la especie silvestre de papa Solanum kurtzianum dentro de la Reserva Natural Villavicencio, Mendoza, en dos jardines experimentales (JE) ubicados a 1.200 y 2.200 m s.n.m., diferencia en altitud que genera variaciones significativas en los niveles de radiacion, temperatura y humedad. Se observaron diferencias significativas en el fenotipo entre plantas cultivadas en los diferentes JE y entre los anos de cultivo. Con la tecnica MSAP (Methylation Sensitive Amplification Polymorphism) se distinguieron patrones de metilacion diferenciales entre clones en funcion al JE y al ano en que fueron cultivados. Se encontro correlacion significativa entre variabilidad fenotipica y epigenetica (r=0,28; p=0,013). A traves de trasplantes reciprocos entre JE, se encontro que en cada ano los clones presentaron patrones de metilacion caracteristicos del jardin en el cual fueron cultivados, demostrando la reversibilidad de las marcas epigeneticas establecidas en anos anteriores. Estos resultados indican la importancia de la variacion epigenetica en la plasticidad fenotipica y la aclimatacion de esta especie.

GGM 8
DESARROLLO DE MARCADORES MOLECULARES MEDIANTE GBS-DDRAD EN SORGO DE ALEPO

Ulrich N.¹, A. Gutiérrez^2,3, N. Aguirre^1,2, C. Filippi^1,2, E. Hopp¹, D. Tosto^1,4.

¹ Instituto de Biotecnología, CICVyA-INTA Castelar Buenos Aires, Argentina;
² Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, Argentina;
³ Laboratorio de Investigaciones Botánicas, Universidad Nacional de Salta, Salta, Argentina;
⁴ FCEyN, Universidad de Buenos Aires, Argentina.
E-mail: tosto.daniela@inta.gob.ar

La resistencia a glifosato (RG) constituye el caracter mas difundido en cultivos transgenicos, y la presion de seleccion que se ejerce sobre las malezas que son blancos de la accion del herbicida son unicas en la historia. En Argentina se comunicaron numerosos focos de RG en Sorgo de Alepo en distintos puntos del pais. Con el objetivo de contribuir con el desarrollo de herramientas moleculares especificas para sorgo de alepo, se realizo un ensayo de genotipificacion por secuenciacion (GBS) basado en la restriccion con dos enzimas (GBS-ddRAD). Se secuenciaron fragmentos paired-end de 450-550 pb de dos genotipos, resistente (R) y suceptible (S) a glifosato, en un equipo Miseq (Illumina). Se utilizo el software Bowtie 2 para mapear las reads obtenidas contra el genoma de referencia disponible de Sorghum bicolor (uno de los genomas diploides que dio origen al Sorghum halepense que es tetraploide). El 69,53% de las reads del genotipo S y el 70,36% de las reads del genotipo R mapearon al menos una vez contra la referencia. Para la busqueda de los SNPs se utilizo el modulo "ref_map" del software Stacks. El analisis de las secuencias permitio encontrar 14886 SNPs en 6604 regiones polimorficas secuenciadas en ambos genotipos (a razon de 2,25 SNPs por region). Los marcadores polimorficos detectados se encuentran distribuidos en los 10 cromosomas de S. bicolor. Las herramientas moleculares generadas podran ser utilizadas tanto en analisis poblacionales como para realizar estudios que permitan establecer los posibles mecanismos involucrados en conferir la resistencia.

GGM 9
UTILIZACION DE GBS-DDRAD PARA EL DESARROLLO DE MARCADORES MOLECULARES DE Stetsonia coryne (Cactaceae)

Gutiérrez A.^1,2, C. Acuña³, N. Aguirre^2,3, C.V. Filippi^2,3, A. Puebla³, S.D. Tosto^2,3, P. Ortega Baes^1,2.

¹ Laboratorio de Investigaciones Botánicas, Universidad Nacional de Salta;
² Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas;
³ Instituto de Biotecnología, CICVyA-INTA Castelar.
E-mail: angelaagutierrez@gmail.com

El Noroeste argentino es el centro de diversidad mas importante de la familia Cactaceae en el pais. Muchas de estas especies enfrentan amenazas que podrian estar afectando la variabilidad genetica de sus poblaciones. El estudio de la estructura poblacional de las especies de esta familia es incipiente debido, principalmente, a que existen pocos marcadores moleculares disenados que permitan estudiar su variabilidad. Con el objetivo de buscar marcadores moleculares especificos para estudiar la variabilidad genetica de la cactacea columnar Stetsonia coryne, se realizo un ensayo de genotipificacion por secuenciacion basado en restriccion con dos enzimas (GBS-ddRADseq)SphI/MBoI. Se secuenciaron fragmentos de 450-550 pb de dos individuos geograficamente distantes en un equipo Miseq (Illumina), con lecturas paired-end. El analisis de las secuencias, utilizando la funcion "De novo" del software Stacks, permitio encontrar 5933 SNPs en 4519 regiones secuenciadas en las dos muestras. Con el programa MISA se buscaron microsatelites en los fragmentos secuenciados y se encontraron un total de 3052 SSR putativos. El analisis in silico de las dos muestras analizadas, revelo 22 loci polimorficos, para los cuales con el programa Primer3 se disenaron los primers correspondientes. Estos marcadores seran una herramienta fundamental para encarar estudios de diversidad genetica y estructura poblacional de S. coryne, que permitiran la creacion y delimitacion de areas de conservacion para esta y otras cactaceas del pais.

GGM 10
IDENTIFICACIÓN DE LOCI MICROSATÉLITES A PARTIR DEL TRANSCRIPTOMA DE Calophyllum brasiliense (Calophyllaceae)

Roulet M.E.¹, C.B. Percuoco^1,2, L.N. Talavera Stéfani¹, A.M. Mina¹, S.L. Litwiñiuk¹, C.A. Rojas³, M.M. Miretti¹, C.F. Argüelles^1,2.

¹ Grupo de Investigación en Genética Aplicada (GIGA), Instituto de Biología Subtropical FCEQyN-IBS Nodo Posadas UNaM-CONICET, Argentina;
² Cátedra de Genética Molecular, Departamento de Genética, FCEQyN, UNaM, Posadas, Misiones, Argentina;
³ Universidade Federal da Integração Latinoamericana (UNILA), Foz do Iguaçu, SC, Brasil.
E-mail: giga@fceqyn.unam.edu.ar

Calophyllum brasiliense es un arbol perennifolio que se distribuye desde el Sur de Mexico hasta el Noreste de Argentina. Las poblaciones descritas en Argentina, localizadas en las provincias de Corrientes y Misiones, se encuentran fragmentadas por accion antropica. Las caracterizaciones geneticas disponibles fueron realizadas mediante marcadores moleculares dominantes. No obstante, se requiere el uso de marcadores con alto valor informativo para contribuir a la conservacion de estas poblaciones. En el presente trabajo, utilizando Msatcommander, se identificaron y caracterizaron loci microsatelites en C. brasiliense a partir del primer transcriptoma recientemente disponible para esta especie. Se optimizaron criterios de busqueda para la identificacion de los SSRs entre ellos: el motivo de repeticion (di/tri/ tetranucleotidico), el numero minimo de repeticiones (8/7/6 respectivamente) usando como referencia las unidades de repeticion publicadas para C. inophyllum. Se escogieron aquellos SSRs que demostraron algun nivel de polimorfismo (2 a 4 alelos) en el transcriptoma de C. brasiliense, identificandolos mediante el software BioEdit y, utilizando Primer3 se disenaron cebadores para la amplificacion de 30 loci microsatelites. Los cebadores fueron disenados para generar amplicones en tres rangos de tamanos: 150-262, 300-466, 500- 689 pb. En el presente trabajo se describen por primera vez cebadores que revelan marcadores codominantes especificos que facilitaran la evaluacion de la estructura genetica de las poblaciones de C. brasiliense a lo largo de toda su distribucion.

GGM 11
DESARROLLO DE UN PROTOCOLO PARA LA DETECCIÓN MOLECULAR DE RELACIONES TRÓFICAS EN SISTEMAS DE PRODUCCIÓN HORTÍCOLA

Cagnotti C.¹, S. López¹, L. Peluffo², M. Viscarret¹, D. Tosto^2,3,4.

¹ IMyZA, CICVyA-INTA Castelar Buenos Aires, Argentina;
² Instituto de Biotecnología, CICVyA-INTA Castelar Buenos Aires, Argentina;
³ Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, Argentina;
⁴ FCEyN, Universidad de Buenos Aires, Argentina.
E-mail: cagnotti.cynthia@inta.gob.ar

Con el fin de estudiar las interacciones en la red trofica en dos sistemas horticolas se desarrollo un protocolo mediante la utilizacion de herramientas moleculares. La mosca blanca Trialeurodes vaporariorum y el pulgon Myzus persicae son plagas clave de hortalizas. El predador Tupiocoris cucurbitaceus y el parasitoide Encarsia formosa se encuentran asociados a moscas blancas, en tanto el predador Chrysoperla externa y el parasitoide Aphidius colemani son enemigos naturales de pulgones. El objetivo del trabajo fue desarrollar un protocolo de identificacion molecular especieespecifica para estudiar las relaciones troficas entre las especies mencionadas. Cien hembras de T. cucurbitaceus (en inanicion por 24 h) fueron alimentadas con ninfas de moscas blancas durante 3 h. Las hembras se fijaron a distintos tiempos de finalizada la alimentacion. Por otra parte, ninfas de moscas blancas fueron expuestas a E. formosa durante 24 h. En los siguientes 12 dias, 300 ninfas expuestas se fijaron diariamente para estimar el tiempo a partir del cual se puede detectar el parasitismo. En el segundo sistema se fijaron larvas de crisopas alimentadas con pulgones y se fijaron pulgones parasitados por A. colemani. Se secuencio una region de la COI en las distintas especies a partir de individuos en inanicion. Se compararon las secuencias y se identificaron variantes distintivas de cada especie. En base a estas se disenaron dos sets de primers especie-especificos y adecuados para realizar la deteccion simultanea de la presa, el predador y el parasitoide en ambos sistemas.

GGM 12
AISLAMIENTO DE GENOTIPO PATÓGENO DE Acanthamoeba DEL RÍO VAQUEROS, SALTA, ARGENTINA

Sanguino Jorquera D.G.^1,2, H.R. Poma¹, V. Irazusta^1,2, V.B. Rajal^1,3, M.M. Juarez^1,3,4.

¹ Laboratorio de Aguas y Suelos, Instituto de Investigaciones para la Industria Quimica (INIQUI), CCT Salta, CONICET-Universidad Nacional de Salta;
² Facultad de Ciencias Naturales, UNSa;
³ Facultad de Ingenieria, UNSa;
⁴ Facultad de Ciencias de la Salud, UNSa.
E-mail: diegosj93@gmail.com

Acanthamoeba es un genero de ameba de vida libre cosmopolita y de gran importancia, ya que algunos de sus genotipos pueden causar lesiones cutaneas, queratitis o encefalitis. El agua cumple un rol importante como diseminador y nicho ecologico. El objetivo del trabajo fue la identificacion genotipica y el analisis filogenetico de cepas de Acanthamoeba aisladas de agua del rio Vaqueros, Salta, Argentina. Los aislamientos fueron realizados de muestras de agua (20 l) colectadas en estacion seca y humeda; posteriormente concentradas por ultrafiltracion. Alicuotas de cada concentrado fueron sembradas en placas de agar no nutritivo e incubadas a 30° C durante 15 dias con observacion regular en microscopio optico para aislamiento de colonias de amebas. La determinacion del genero y del genotipo de los aislados se logro empleando PCR convencional para amplificacion del gen que codifica la region 18s del ARNr, ASA.S1 y luego secuenciacion con la tecnica de Sanger. De un total de 29 aislados, solo nueve resultaron positivos para el genero Acanthamoeba y todos pertenecieron al genotipo T4, subgrupo A. El analisis filogenetico de las cepas de Acanthamoeba aporto informacion muy util, revelando diferencias puntuales que originaron dos grupos estrechamente relacionados. Los antecedentes bibliograficos muestran que el genotipo T4 es el de mayor frecuencia de aislamientos en muestras ambientales, siendo productor de queratitis y encefalitis, por lo que representa un riesgo para la salud publica.

GGM 13
EVALUACIÓN DE MARCADORES GENÉTICOS MEDIANTE ANÁLISIS IN SILICO PARA DETERMINAR ESPECIES DEL ORDEN PLAGIORCHIIDA (Trematoda: Digenea)

Saravia J.D.¹, D.A. Davies¹, H.A. Cristóbal^2,3.

¹ Instituto para el Estudio de la Biodiversidad de Invertebrados, Facultad de Ciencias Naturales, UNSa;
² Instituto de Investigaciones para la Industria Química-CONICET, UNSa;
³ Facultad de Ciencias Naturales, UNSa.
E-mail: joseds069@gmail.com

El orden Plagiorchiida es un grupo complejo dentro de los trematodes, en el que muchas veces la morfologia es insuficiente para la determinacion de especies. Las tecnicas moleculares mejoran las posibilidades de discriminacion entre especies; actualmente se emplean marcadores geneticos para, entre otras aplicaciones, distinguir entre especies cripticas o realizar estudios filogeneticos. El objetivo del trabajo fue evaluar cebadores, publicados y disenados para el operon ribosomal (ADNr) y citocromo oxidasa subunidad 1 (COI) que permiten la determinacion de generos y especies del orden Plagiorchiida. Se utilizaron herramientas bioinformaticas, como Primer-Blast y DNA-MAN, para analizar 5 juegos de cebadores para COI y 7 juegos para ADNr obtenidos de bibliografia y se disenaron cebadores para ambos marcadores a partir de un multiple alineamiento de secuencias publicadas en la base de datos del NCBI. Los resultados in silico muestran que los sistemas que amplificaron productos de mayor tamano (2792 pb) fueron BD1F y JS2R para ADNr con la deteccion de 49 especies y el sistema PJ2COIF y 10030R para COI (2149 pb) que identifica 10 especies. Los sistemas JB10F y JB9R que amplifican 304 pb para ADNr detectan 79 especies de interes; por otro lado, el set JB3F y JB4.5R amplifica 444 pb para COI identificando 15 especies. Los sistemas mas prometedores para determinar especies de interes fueron BD1F - JS2R y PJ2COIF - 10030R. La presente evaluacion bioinformatica de marcadores geneticos establece las bases para un posterior analisis filogenetico en parasitos del orden Plagiorchiida.

GGM 14
CARACTERIZACIÓN DEL GEN TYR EN LLAMAS (Lama glama)

Fernández E.¹, M. Anello¹, M. Silbestro¹, L. Vidal Rioja¹, F. Di Rocco¹.

¹ Instituto Multidisciplinario de Biología Celular (IMBICE)-CIC-CONICET-UNLP.
E-mail: fdirocco@imbice.gov.ar

La llama es una especie productora de fibra que presenta una gran diversidad de colores y patrones. Ademas del diametro y del largo, el color de la fibra es uno de los principales determinantes de su valor comercial. Hasta el momento, solo se ha descripto la secuencia y variacion de unos pocos genes relacionados al color de capa en esta especie. Uno de los principales reguladores de la melanogenesis es el gen TYR, que codifica la enzima tirosinasa, esencial para la sintesis de las melaninas. El objetivo de este trabajo fue caracterizar este gen y describir las variantes alelicas existentes en llamas. Para ello, se tomaron muestras de sangre de 18 animales no relacionados y se extrajo el ADN genomico. Se disenaron 5 pares de primers sobre el genoma de alpaca (GCA_000164845.2), disponible en Genome Browser, y se amplificaron por PCR los exones del gen con sus correspondientes regiones flanqueantes. Los amplificados fueron corroborados por electroforesis en geles de agarosa al 1,5% y secuenciados. Las secuencias obtenidas fueron alineadas y analizadas con el programa Genious 6.1.8. El gen TYR de llama consta de 1593 pb organizados en 5 exones que codifican una proteina de 530 aminoacidos. Se observaron 12 SNPs en la region codificante, 8 sinonimos y 4 no sinonimos. En las regiones no codificantes adyacentes a los exones, se encontraron 7 polimorfismos: 4 SNPs, 2 microsatelites y un homopolimero de longitud variable. La relacion de estos polimorfismos con la variacion de color debera evaluarse en futuros estudios de asociacion genotipo-fenotipo.