ARTÍCULOS ORIGINALES

Nuevos marcadores mitocondriales mejoran la filogenia de la tortuga carey Eretmochelys imbricata (Testudines: Cheloniidae)

New mitochondrial markers improve the phylogeny of the hawksbill turtle Eretmochelys imbricata (Testudines: Cheloniidae)

 

Beltrán-Torres G.C.¹, Hernández-Fernández J.^1,*

¹ Universidad Jorge Tadeo Lozano, Facultad de Ciencias Naturales e Ingeniería. Grupo de Investigación en Genética, Biología Molecular y Bioinformática-GENBIMOL, Carrera 4 No. 22-61, Bogotá, Colombia.
* Autor correspondiente: javier.hernandez@utadeo.edu.co

Fecha de recepción: 12/12/2017
Fecha de aceptación de versión final: 10/08/2018

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RESUMEN

Las tortugas marinas (Cheloniidae) son un grupo de siete especies originadas en el cretaceo. Analisis de secuencias parciales de DNA mitocondrial han revelado inconsistencias filogeneticas dentro de este grupo de quelonios. Sin embargo, estos marcadores mitocondriales han permitido entender y dilucidar la composicion de las poblaciones en areas de forrajeo, habitos reproductivos, inferencias de patrones de migracion y tambien definir las unidades de manejo en el mundo, con el fin de proponer planes de manejo y conservacion. El objetivo de este estudio fue evaluar la posicion de la tortuga carey E. imbricata dentro de la familia Cheloniidae y la filogenia de las tortugas marinas utilizando genes mitocondriales codificantes de proteinas, genes ribosomicos y el genoma mitocondrial completo de la tortuga carey anidante del Caribe colombiano, al compararlo con las otras seis especies de tortugas marinas disponibles en GenBank. Se utilizaron cuatro metodos de inferencias filogeneticas: Neighbor-Joining (NJ), Maxima Verosimilitud (ML), Maxima Parsimonia (MP) e Inferencia Bayesiana (IB). Los arboles NJ, ML, MP e IB mostraron que ND2, COX1, 16S ARNr, ND5, 12S ARNr, ND4, COX3 y ND1 son los marcadores que presentan una mejor resolucion filogenetica con sustentos bootstrap entre 89,0% y 99,98%. Los genes ATP6, ATP8, COX2, ND3, ND4L y ND5 presentaron politomias y establecieron relaciones filogeneticas equivocadas. El analisis con el mitogenoma completo presento arboles altamente sustentados (bootstrap de 98,0%) en comparacion con el analisis con marcadores individuales. Los arboles obtenidos con el gen ND2 e IB resolvieron con buen sustento las relaciones evolutivas entre las especies comparadas, consolidandose la posicion de E. imbricata dentro de la tribu Carettini con probabilidad posterior de 0,98-1,0. Los marcadores ND2, ND5, ND4, COX3 y ND1 no han sido utilizados en trabajos previos y representan una nueva alternativa para explicar la filogenia en este grupo de reptiles marinos. En el presente caso utilizando mitogenomas completos se obtuvieron arboles robustos y altamente sustentados.

Palabras clave: Relaciones filogeneticas; Eretmochelys imbricata; Mitogenoma; Tortugas marinas; Bootstrap; Politomias.

ABSTRACT

The sea turtles (Cheloniidae) are a group of seven species of cretaceous origin. Analyses of partial mitochondrial sequences have revealed phylogenetic inconsistences within this group. Nevertheless, these mitochondrial markers have allowed us to understand, explain and clarify population composition in areas of foraging, reproductive habits, inferences of migration patterns and, also, to define management units in the world, in order to trace conservation and monitoring plans. In this study, four methods were evaluated and compared for phylogenetic inference (Neighbor-Joining-NJ, Maximum Likelihood-ML, Maximum Parsimony-MP and Bayesian inference-BI) by using coding genes, ribosomal genes and full mitogenomes of the hawksbill, E. imbricata, and other six species of sea turtles obtained from GenBank. The sequences were analyzed independently and jointly to identify the method and marker that better explain the phylogenetic relationships among this group of reptiles. The NJ, ML, MP and BI trees showed that ND2, COX1, 16S rRNA, ND5, 12S rRNA, ND4 and COX3 are the markers that give phylogenetic trees with better resolution and support, with bootstrap values ranging from 89.0% to 99.98%. ATP6, ATP8, COX2, ND1, ND3, ND5 and ND4L genes presented polytomies. The analysis with full mitogenome often provides highly supported trees (bootstrap 98.0%) compared with single marker analysis. Trees obtained with the BI method and the ND2 gene is the one that better resolved the evolutionary relationships among the species, consolidating the position of E. imbricata within the Carettini tribe with a value of posterior probability of 0.98-1.0. The markers ND2, ND4, ND5 and COIII, not used in previous works, represent a new alternative to explain the phylogeny in this group of marine reptiles. In the present study, a complete mitogenome analysis produced robust and highly supported trees.

Key words: Phylogenetic relationships; Eretmochelys imbricate; Mitogenoma; Sea turtles; Bootstrap; Polytomies.

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INTRODUCCIÓN

Las tortugas marinas son reptiles que aparecieron en el cretacico, han poblado los mares del mundo por mas de 200 millones de anos (Marquez y del Carmen Farias, 2000) y ocupan una amplia diversidad de habitats oceanicos y costeros. La tortuga carey es componente relevante de diferentes habitats vitales para el ecosistema (arrecifes de coral, praderas de pastos marinos, fondos blandos) (Kinan, 2002). Las tortugas marinas realizan migraciones de miles de kilometros y tardan decadas para madurar sexualmente, por lo tanto, sirven como importantes indicadores de la salud de los ambientes costeros y marinos tanto a escala local como global (Eckert et al., 2000; Heithaus, 2013).
Actualmente existen dos familias de tortugas marinas, Cheloniidae, representada por seis especies, la tortuga plana (Natator depressus), la tortuga golfina (Lepidochelys olivacea), la tortuga lora (Lepidochelys kempii), la tortuga caguama (Caretta caretta), la tortuga carey (E. imbricata) y la tortuga verde (Chelonia mydas) (Pritchard, 1999); y la familia Dermochelyidae, representada hoy en dia por una sola especie, la tortuga laud (Dermochelys coriacea) (Trujillo- Arias et al., 2014). De la primera familia anidan y/o se alimentan en las costas colombianas: C. caretta, C. mydas, E. imbricata, L. olivacea y L. kempii, mientras que de la segunda familia se encuentra a D. coriacea. Todas estas especies anidan en las dos costas, con excepcion de L. kempii que lo hace unicamente en la costa Atlantica (Ceballos-Fonseca, 2000).
La tortuga carey E. imbricata (Linnaeus, 1766), es considerada una especie circumtropical que se encuentra en aguas costeras y se distribuye en las playas de 108 unidades geopoliticas (Meylan y Donnelly, 1999). Esta tortuga se reporto por primera vez como especie en peligro por la IUCN en 1968. En 1996 su estatus cambio a especie en peligro critico, ademas, se encuentra registrada en el apendice I del CITES (Amorocho, 1999; Revuelta y Tomas, 2010; Tabib et al., 2011). Estudios realizados por Bass et al. (1996), Bowen et al. (1996; 2007), Bass (1999), Abreu-Grobois (1999), Troeng et al. (2005), Lara-Ruiz et al. (2006), Velez-Zuazo et al. (2008), Blumenthal et al. (2009), Browne et al. (2010), Monzon-Arguello et al. (2010; 2011), Leroux et al. (2012) y Trujillo-Arias et al. (2014) con marcadores moleculares mitocondriales han permitido establecer la composicion poblacional de la tortuga carey y describir parte de su historia de vida. Ademas, estos estudios basados en marcadores mitocondriales han permitido evaluar hipotesis sobre comportamientos reproductivos y filogeograficos, composicion de poblaciones de forrajeo e inferencia de patrones de migracion. El conocimiento de la estructura genetica puede ser utilizada para definir unidades de manejo, estrategia util en planes de conservacion (Kinan, 2002). Por otro lado, se ha demostrado que en el ADNmt se acumulan y fijan mutaciones con mayor rapidez que en el nuclear, proceso que ha sido atribuido a una tasa de mutacion rapida durante la replicacion y a un tamano poblacional menor por su herencia estrictamente maternal (Avise et al., 1992; Liu y Cordes, 2004; Drosopoulou et al., 2012).
EL ADNmt de tortugas marinas y de vertebrados en general, consiste en una molecula circular de doble cadena la cual codifica para 22 ARNt, 2 ARNr, 13 proteinas, y una region mayor no codificable (region control, D-loop) la cual contiene senales para la transcripcion y replicacion mitocondrial (Boore, 1999; Drosopoulou et al., 2012). Los primeros estudios de filogenia sobre tortugas marinas fueron realizados por Zangerl et al. (1988) y Limpus et al. (1988), ellos trabajaron en morfologia y electroforesis de proteinas respectivamente. Sin embargo, estos primeros arboles presentaron inconsistencias dentro de la familia Cheloniidae. Estudios realizados por Bowen et al. (1993), Dutton et al. (1996) y Naro-Maciel et al. (2008) presentaron resultados en los que se demuestra la formacion de un grupo monofiletico y de dos tribus, Chelonini (C. mydas y N. depressa) y Carettini (L. olivacea, L. kempii, C. caretta y E. imbricata). El uso de diferentes marcadores moleculares ha permitido dilucidar diferentes relaciones filogeneticas, tal es el caso de la tortuga plana (N. depressa) que se situaba como taxon hermano de Carettini, basandose en los genes ND4, Cytb y la region control (Dutton et al., 1996). Utilizando una mayor cantidad de datos, los genes 12S ARNr, 16S ARNr y cuatro genes nucleares, N. depressa, se agrupo con C. mydas (Naro- Maciel et al., 2008).
Actualmente se ha podido secuenciar mitogenomas completos de tortugas marinas (Duchene et al., 2012; Frey y Dutton, 2012; Shamblin et al., 2012), aumentando la cantidad de informacion generada, pasando de estudios que producian conclusiones basadas en secuencias de genes de 2000 pb a estudios que utilizan mas de 16000 pb. Los nuevos estudios han permitido proponer nuevas relaciones evolutivas entre las especies de quelonidos (Duchene et al., 2012) y confirmar evidencias previas en las que se determinaba que el reloj molecular en tortugas marinas es mucho mas lento que otros linajes de vertebrados (Avise et al., 1992; Duchene et al., 2012). El uso de esta informacion filogenetica ha permitido resolver un debate en ecologia evolutiva al realizar un mapeo sobre el arbol de relaciones de los habitos alimenticios, el cual indico que la tortuga espongivora E. imbricata evoluciono de un antepasado carnivoro y no de uno herbivoro como se tenia entendido (Bowen et al., 1993). En el presente estudio, con los datos obtenidos en estudios previos de la secuencia del mitogenoma de una tortuga carey y las secuencias de mitogenomas obtenidos en bases de datos para otras seis tortugas marinas, se realizaron analisis en primer termino para estudiar cual de 15 marcadores resuelven con mayor sustento la posicion de la tortuga carey E. imbricata dentro de la familia Cheloniidae y la filogenia de las tortugas marinas, y en segundo termino, para evaluar el uso del mitogenoma completo y compararlo con los analisis filogeneticos realizados con fragmentos parciales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Secuenciación: La estandarizacion y obtencion del mitogenoma de la tortuga carey E. imbricata se publico previamente en GenBank (KP221806) (Beltran-Torres et al., 2013). Este mitogenoma se obtuvo amplificando 24 fragmentos contiguos de 800-1000 pb solapados en 50-100 pb. Los fragmentos amplificados se secuenciaron en ambas direcciones (5’-3’ y 3’-5’) utilizando el metodo automatizado tagDyeDeoxy Terminator Cycle-sequencing en un secuenciador 3730XL (Applied Biosystems) en SSIGMOL (Universidad Nacional de Colombia: http://www.ssigmol.unal.edu.co/). Las secuencias obtenidas se alinearon y ensamblaron utilizando el programa Geneious R6 (Biomatters Ltda., Nueva Zelanda), posteriormente se compararon con las secuencias reportadas en la base de datos del NCBI para todas las tortugas carey (Tabla 1) mediante la herramienta de busqueda de alineamiento basico local BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) para determinar su identidad, y de la misma forma, identificar los genes mitocondriales.

Tabla 1. Referencia de los mitogenomas de las especies de tortugas analizadas. Se presenta la longitud de la secuencia en pares de bases (pb), referencia bibliográfica y el número de entrada para la base de datos de GenBank.

Análisis de datos
Se realizaron cuatro analisis filogeneticos utilizando los algoritmos Neighbor-Joining (NJ), Maxima Verosimilitud (ML) e Inferencia Bayesiana (IB) utilizando el programa Geneious R6 (Biomatters Ltda., Nueva Zelanda) y Maxima Parsimonia (MP), utilizando MEGA 5.2. (Tamura et al., 2011). Los analisis filogeneticos se realizaron utilizando genes individuales (12S ARNr, 16S ARNr, COX1, COX2, COX3, ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5, ND6, CytB, ATP6 y ATP8) y mitogenomas completos de la tortuga carey, anidante del Caribe colombiano de este estudio, y cuatro individuos de carey previamente descritos (Duchene et al., 2012 y Tandon et al. (datos no publicados) con secuencias de seis tortugas marinas disponibles en la base de datos de GenBank (Tabla 1). Adicionalmente, se utilizaron las secuencias de la tortuga acuatica, Trachemys scripta, y de la tortuga terrestre, Geochelone nigra, como grupo externo. Los modelos de sustitucion Tamura-Nei (TN), Hasegawa, Kishino y Yano (HKY) y Generalised Time Reversible (GTR) usados para realizar los arboles filogeneticos de NJ, ML e IB, respectivamente, se escogieron con base a los menores puntajes obtenidos en los resultados de Bayesian Information Criterion (BIC) utilizando MEGA 5.2. (Nei y Kumar, 2000; Tamura et al., 2011) y de forma independiente para cada juego de datos y cada gen analizado. Para NJ, ML y MP se realizaron 1000 replicas de bootstrap. Se consideraron valores bootstrap ≥70% como sustento aceptable para los diferentes clados obtenidos, de acuerdo a Hillis y Bull (1993). Para el algoritmo de IB se utilizaron cuatro cadenas de MCMC, por 20 millones de generaciones, muestreando cada 2000 generaciones. El arbol consenso fue construido con los ultimos 1000 arboles (burn-in=9000 muestras), y se obtuvo un arbol consenso con valores de probabilidad posterior (PP).

RESULTADOS

El mitogenoma completo obtenido de la tortuga carey anidante del Caribe colombiano posee un tamano de 16386 pb. Al analizar la secuencia con la herramienta BLASTX se identificaron los trece genes codificantes de proteinas (ATP6, ATP8, COX1, COX2, COX3, ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5, ND6 y CytB), dos genes ribosomicos completos (12S ARNr y 16S ARNr) y 22 ARNt. Mediante el analisis BIC se evaluaron los modelos de sustitucion (Tabla 2). El mejor modelo para interpretar los genes 12S ARNr, ATP6, COX1, COX2, COX3, ND2, ND4 y ND6 fue TN, para los genes ATP8 y ND4L fue HKY y para los genes 16S ARNr, CytB, ND1, ND3, ND5 y el mitogenoma completo fue GTR (Tabla 2). De acuerdo con estos resultados se realizaron los analisis filogeneticos.

Tabla 2. Puntajes BIC para los trece genes codificantes de proteínas y dos genes ribosomales evaluados. Referencia BLAST: E. imbricata números de entrada NC_012398, JX454986, JX454980, JX454970.

En la Figura 1 se muestran los arboles obtenidos con los diferentes analisis filogeneticos realizados con los cuatro criterios de busqueda y generando un arbol consenso en aquellos que demostraron una asociacion congruente para este grupo de reptiles. Se demostro que los dos genes ribosomicos, 12S ARNr y 16S ARNr, y los cinco genes codificantes de proteinas COI, COIII, ND2, ND4 y ND5 son los marcadores que resuelven con la misma topologia la filogenia de este grupo de reptiles, diferenciando las dos familias existentes, Dermochelyidae, con una unica especie, D. coriácea, y Cheloniidae, donde se encuentran las otras seis especies de tortugas marinas. Se agrupan de forma congruente las dos tribus: la tribu Chelonini, con N. depressa y C. mydas, y la tribu Caretini, con las tortugas L. kempii, L. olivácea, C. caretta y E. imbricata. Dentro de la tribu Carettini las dos especies de Lepidochelys forman un grupo hermano, uniendose basalmente al taxon hermano de C. caretta; estas tres especies forman un grupo hermano con E. imbricata. En todos los casos siempre se agrupan bajo un mismo nodo las diferentes tortugas carey utilizadas como referencia y la secuenciada obtenida por Beltran-Torres et al. (2013) como parte de este estudio. En las Figuras 1A, 1B, 1C y 1E, construidas con los genes individuales 12S ARNr, 16S ARNr, COI y ND2 respectivamente, se presenta una politomia dentro del grupo carey, que corresponde a las tortugas del Pacifico; se observa que estos genes explican una diferenciacion geografica en forma general pero no especifica entre regiones.

Figura 1. Árbol consenso por regla de mayoría obtenido A. Análisis del gen ribosomal 12S ARNr (993 pb) B. Análisis del gen ribosomal 16S ARNr (1,663 pb). C. Análisis del gen COI (1,556 pb) D. Análisis del gen COIII (786 pb) E. Análisis del gen ND2 (1,048 pb) F. Análisis del gen ribosomal ND4 (1,385 pb) G. Análisis del gen ND5 (1,846 pb) H. Análisis de mitogenomas completos (>16 500). Los valores ubicados en los nodos hacen referencia a la probabilidad posterior de IB/ y bootstrap obtenidos con los métodos de ML/ MP/ y NJ/. * Familia Dermochelyidae.

A pesar de que estos siete genes mitocondriales explican de la misma manera la filogenia de las tortugas marinas (Figura 1), no todos los algoritmos usados muestran la misma filogenia en los diferentes casos. Para el gen ribosomico 12S ARNr se descarto el arbol por NJ debido a la baja resolucion obtenida de la tribu Carettini. Lo mismo ocurrio con el arbol generado por NJ con el gen COIII, que presento politomias en la diferenciacion de las familias y dentro de la tribu Carettini. Para el gen ND2 los algoritmos NJ y MP presentaron politomias y sustentos inferiores al 50%, ademas de asociaciones atipicas dentro de la tribu Carettini (figura no presentada).
El arbol generado por NJ utilizando el gen ND5 presento politomias en diferentes ramas. El metodo IB permite mostrar siempre un arbol dicotomico, el cual presenta los mejores sustentos por nodo desarrollando de manera congruente la filogenia tipica de este grupo de reptiles, seguido por ML, MP y NJ.
Los arboles generados por los genes ATP6, ATP8, COII, ND3, ND4L, ND6 y CytB se descartaron ya que los sustentos bootstrap que presentaron en diferentes clados se encontraron por debajo del 70%. Ademas, mostraban politomias y generaron asociaciones atipicas de las especies en las diferentes metodologias.

DISCUSIÓN

Las secuencias obtenidas de todos los genes y el genoma mitocondrial completo de la tortuga carey de este estudio mostraron una alta similitud con las secuencias de la tortuga carey previamente descritas en la base de datos de GenBank. Cuando se utilizaron los mitogenomas completos para generar la filogenia se obtuvieron arboles mas robustos y con mejores sustentos (81,0-100%), debido a que son genes que se encuentran estrechamente ligados en una sola molecula y ofrecen en conjunto una mayor informacion de datos y de esta manera permiten obtener resultados mas robustos. En cuanto a los arboles con base en genes individuales, los que presentaron mejores conformaciones con sustentos mas altos fueron: 16S ARNr (88,0-100%), COI (64,0-100%), ND2 (59,0-100%), ND4 (56,0-100%), ND5 (55,0-100%), 12S ARNr (50,0-100%) y COIII (50,0-100%).
En estudios previos los metodos utilizadas de filogenia se basaron en solo uno de los diferentes algoritmos, NJ (Duchene et al., 2012), MP (Dutton et al., 1996; Naro- Maciel et al., 2008) ML (Duchene et al., 2012) e IB (Naro- Maciel et al., 2008; Drosopoulou et al., 2012). En este estudio se utilizaron los cuatro algoritmos mas comunes para determinar cual de ellos explica mejor y se ajusta a las representaciones filogeneticas en tortugas marinas. Los arboles producidos por NJ son arboles feneticos; es un algoritmo muy popular que se basa en el agrupamiento por similitudes entre secuencias, con un modelo de evolucion molecular basico y de probabilidades, lo que lo hace un arbol sencillo y basico para unos primeros analisis filogeneticos (Willems et al., 2014). Los otros tres metodos producen una resolucion mas robusta, poseen algoritmos que identifican similitudes y dependiendo del modelo de sustitucion utilizado, generan puntajes y penalidades a las diferencias que se encuentren, ya sea por transiciones o transversiones entre bases nucleotidicas, y tienen en cuenta variaciones de frecuencia de cada nucleotido (Nei y Kumar, 2000). En el presente estudio se encontro que los arboles generados por IB son los que poseen la mejor representacion filogenetica en las tortugas marinas, obteniendo valores de probabilidades posteriores promedio de 0,94. IB no solo tiene en cuenta transiciones y transversiones en las bases nucleotidicas, sino que tambien se basa en probabilidades posteriores de cambios en dichas bases, teniendo en cuenta: tasas mutacionales, probabilidades anteriores del parametro y verosimilitud de los datos (Nei y Kumar, 2000). IB es un metodo completo que evalua tambien relojes moleculares y da ventajas en los analisis por el uso de informacion a priori y su velocidad de procesamiento (Nei y Kumar, 2000; Duchene et al., 2011). Los marcadores moleculares con base en genes individuales utilizados para explicar la filogenia de tortugas marinas y que han generado las mejores explicaciones y propuesto las mejores relaciones han sido construidos con los genes 12S ARNr y 16S ARNr (Naro-Maciel et al., 2008), Region Control (Dutton et al., 1999) y el conjunto de ND4-tRNALeu-citocromo B-region control (Dutton et al., 1996). Sin embargo, no en todos los estudios realizados tienen en cuenta el analisis por modelos de sustitucion de bases nucleotidicas. Ademas, tampoco describen los valores bootstrap que dan sustento a los arboles descriptos, para determinar si tienen el indice de confianza minimo necesario para explicar la filogenia en este grupo de reptiles.
Duchene et al. (2012) determinaron mediante analisis BIC, que el modelo que se ajusta para realizar la filogenia con base en mitogenomas completos es GTR, resultado igual al obtenido en este estudio. Duchene et al. (2011) realizaron este mismo analisis para genes mitocondriales individuales en delfines y orcas, encontrando que el modelo de sustitucion varia dependiendo de la secuencia del gen analizado, al igual que lo observado en el presente estudio, donde con ocho de los genes (12S ARNr, ATP6, COX1, COX2, COX3, ND2, ND4 y ND6) se utilizo el modelo TN, con dos genes (ATP8 y ND4L) se utilizo HKY y cinco genes (16S ARNr, CytB, ND1, ND3 y ND5) y el mitogenoma completo, se utilizo el modelo GTR.
Los adelantos en tecnologias de secuenciacion han permitido ampliar el uso de rango de los marcadores moleculares, especialmente en mitogenomas, ya sea usando los genes a nivel individual o en conjunto con genomas mitocondriales parciales o completos (Kumazawa y Nishida, 1999; Duchene et al., 2012). Duchene et al. (2011) realizaron trabajos de filogenia con marcadores moleculares mitocondriales en delfines y ballenas orcas, demostrando de esta manera que no todos los marcadores poseen la misma resolucion para generar relaciones filogeneticas, sino que por el contrario, dependiendo de la especie o grupo taxonomico al que pertenezcan, algunos marcadores pueden generar explicaciones con mejores sustentos. En estudios previos los marcadores moleculares 16S ARNr y COX1, son los que han explicado con mayor soporte las relaciones filogeneticas de las tortugas marinas (Naro-Maciel et al., 2008), asi como tambien el gen ND4 en conjunto con otros genes (Dutton et al., 1996). Sin embargo, este estudio presenta los marcadores ND2, ND5, ND4, COX3 Y ND1 como nuevas alternativas para este tipo de analisis, debido a que no han sido utilizados con anterioridad y generaron un sustento suficiente, produciendo arboles robustos y explicaciones filogeneticas satisfactorias para las tortugas marinas.
Los estudios de Drosopulou et al. (2012), Duchene et al. (2012), Hernandez et al. (2017) y Hernandez y Delgado (2018) utilizaron los mitogenomas completos de las tortugas para realizar los analisis filogeneticos, demostrando de esta forma lo descrito por Duchene et al. (2011) quienes concluyeron que entre mayor informacion genetica se posea (pares de bases), los arboles filogeneticos y los sustentos de las diferentes ramas van a ser mucho mas robustos y con mejor confianza al momento de obtener los analisis. En este estudio se muestra la misma tendencia ya que el mejor marcador molecular individual fue el gen ND2 (1048 pb) mediante el algoritmo IB con valores de probabilidad posterior de 0,948. El arbol filogenetico obtenido utilizando el algoritmo IB y mitogenomas completos fue el mas robusto, con un soporte de probabilidad posterior de 0,98.

AGRADECIMIENTOS

Al Oceanario CEINER en la Isla de San Martin de Pajarales (Bolivar) y a Jaime Rojas quienes cedieron gentilmente las muestras de sangre de las tortugas para poder realizar esta investigacion. La Financiacion de este estudio fue realizada por el Departamento de Investigacion, Creatividad e Innovacion de La Universidad Jorge Tadeo Lozano. Al Ministerio del Medio Ambiente y Desarrollo Sostenible por otorgar el permiso de Investigacion Cientifica en diversidad Biologica N° 24 de Junio 22 de 2012 y el ANLA por el Contrato de Acceso a Recursos Geneticos N° 64.

BIBLIOGRAFÍA

1. Abreu-Grobois F.A. (1999) Genetica poblacional y filogeografia de las tortugas marinas golfina (Lepidochelys olivacea) y laud (Dermochelys coriacea) en el Pacifico mexicano. Informe final SNIB-CONABIO proyecto No. G007, Mexico.         [ Links ]

2. Amorocho D.F., Network W.C.S.T. (1999) Status and distribution of the hawksbill turtle, Eretmochelys imbricata, in the wider Caribbean region. In: Proceedings of the Regional Meeting “Marine Turtle Conservation in the Wider Caribbean Region: A Dialogue for Effective Regional Management”, Santo Domingo pp. 16-18.

3. Avise J.C., Bowen B.W., Lamb T., Meylan A.B., Bermingham E. (1992) Mitochondrial DNA evolution at a turtle’s pace: evidence for low genetic variability and reduced microevolutionary rate in the Testudines. Mol. Biol. Evol. 9 (3): 457-473.

4. Bass A., Good D., Bjorndal K., Richardson J., Hillis Z., Horrocks J., Bowen B. (1996) Testing models of female reproductive migratory behavior and population structure in the Caribbean hawksbill turtle, Eretmochelys imbricata, with mtDNA sequences. Mol. Ecol. 5: 321- 328.         [ Links ]

5. Bass A.L. (1999) Genetic Analysis to Elucidate the Natural History and Behavior of Hawksbill Turtles (Eretmochelys imbricata) in the Wider Caribbean: a Review and Re- Analysis. Chelonian Conservation and Biology 3 (2): 195-199.         [ Links ]

6. Beltran-Torres G., Otalora-Acevedo K., Daza L.A., Hernandez-Fernandez J. (2013) Estandarizacion de la tecnica de PCR para amplificar el genoma mitocondrial de las tortugas cabezona (Caretta caretta) y carey (Eretmochelys imbricata) anidantes del Caribe colombiano. Mutis 3 (2): 21-30.         [ Links ]

7. Blumenthal J., Abreu-Grobois F., Austin T., Broderick A., Bruford M., Coyne M., Ebanks-Petrie G., Formia A., Meylan P., Godley B. (2009) Turtle groups or turtle soup: dispersal patterns of hawksbill turtles in the Caribbean. Mol. Ecol. 18: 4841-4853.         [ Links ]

8. Boore J.L. (1999) Animal mitochondrial genomes. Nucleic acids research 27 (8): 1767-1780.         [ Links ]

9. Bowen B.W., Nelson W.S., Avise J.C. (1993) A molecular phylogeny for marine turtles: trait mapping, rate assessment, and conservation relevance. Proc. Nat. Acad. Sci. 90 (12): 5574-5577.         [ Links ]

10. Bowen B.W., Bass A.L., Garcia-Rodriguez A., Diez C.E., Van Dam R., Bolten A., Bjorndal K.A., Miyamoto M.M., Ferl R.J. (1996) Origin of hawksbill turtles in a Caribbean feeding area as indicated by genetic markers. Ecol. Appl. 566-572.         [ Links ]

11. Bowen B., Grant W., Hillis-Starr Z., Shaver D., Bjorndal K., Bolten A., Bass A. (2007) Mixed-stock analysis reveals the migrations of juvenile hawksbill turtles (Eretmochelys imbricata) in the Caribbean Sea. Mol. Ecol. 16: 49-60.         [ Links ]

12. Browne D.C., Horrocks J.A., Abreu-Grobois F.A. (2010) Population subdivision in hawksbill turtles nesting on Barbados, West Indies, determined from mitochondrial DNA control region sequences. Conservation Genetics 11: 1541-1546.         [ Links ]

13. Ceballos-Fonseca C.P. (2000) Tortugas (Testudinata) marinas y continentales de Colombia. Biota Colombiana 1 (2): 187-194.         [ Links ]

14. Drosopoulou E., Tsiamis G., Mavropoulou M., Vittas S., Katselidis K.A., Schofield G., Palaiologou D., Sartsidis T., Bourtzis K., Pantis J., Scouras Z.G. (2012) The complete mitochondrial genome of the loggerhead turtle Caretta caretta (Testudines: Cheloniidae): Genome description and phylogenetic considerations. Mitoch. DNA 23 (1): 1-12.         [ Links ]

15. Duchene S., Archer F.I., Vilstrup J., Caballero S., Morin P.A. (2011) Mitogenome phylogenetics: the impact of using single regions and partitioning schemes on topology, substitution rate and divergence time estimation. PLoS One 6 (11): e27138.         [ Links ]

16. Duchene S., Frey A., Alfaro-Nunez A., Dutton P.H., Thomas P., Gilbert M., Morin P.A. (2012) Marine turtle mitogenome phylogenetics and evolution. Mol. Phylo. Evol. 65 (1): 241-250.         [ Links ]

17. Dutton P.H., Davis S.K., Guerra T., Owens D. (1996) Molecular phylogeny for marine turtles based on sequences of the ND4-leucine tRNA and control regions of mitochondrial DNA. Mol. Phylo. Evol. 5 (3): 511-521.         [ Links ]

18. Dutton P.H., Bowen B.W., Owens D.W., Barragan A., Davis S.K. (1999) Global phylogeography of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). J. Zool. 248 (3): 397-409.         [ Links ]

19. Eckert K.L., Bjorndal K.A., Abreu-Grobois F.A., Donnelly M. (2000) Tecnicas de Investigacion y Manejo para la Conservacion de las Tortugas Marinas. Grupo especialista en Tortugas Marinas. Union Internacional para la Conservacion de la Naturaleza y Comision de Supervivencia de Especies.         [ Links ]

20. Frey A., Dutton P.H. (2012) Whole Mitogenomic Sequences for Further Resolution of Ubiquitous D-Loop Haplotypes in Pacific Green Turtles. In: Jones T.T., Wallace B.P. (Eds.) Proceedings of the Thirty-first Annual Symposium on a Turtle Biology and Conservation.         [ Links ]

21. Heithaus M.R. (2013) Chapter 10: Predators, Prey and the Ecological Roles of sea turtles. In Wyneken J., Lohmann K.J., Musick J.A. (Eds.) The Biology of Sea Turtles (Vol. 3), CRC Press.         [ Links ]

22. Hernandez J., Beltran G., Marino-Ramirez L. (2017) Complete mitochondrial genome of the nesting Colombian Caribbean Hawksbill Turtle. Mitochondrial DNA Part B, 2 (1): 128-129, DOI: 10.1080/23802359.2017.1292477.         [ Links ]

23. Hernandez J., Delgado D. (2018) Complete mitochondrial genome of the three Colombian Caribbean loggerhead sea turtles, using next-generations sequencing. Mitochondrial DNA Part B, 3 (2): 626-627, DOI: 10.1080/23802359.2018.1450664.         [ Links ]

24. Hillis D.M., Bull J.J. (1993) An empirical test of bootstrapping as a method for assessing confidence in phylogenetic analysis. System Biol. 42 (2): 182-192.         [ Links ]

25. Kinan I. (2002) Proceedings of the Western Pacific Sea Turtle Cooperative Research and Management Workshop, Western Pacific Regional Fishery Management Council, Honolulu.         [ Links ]

26. Kumazawa Y., Nishida M. (1999) Complete mitochondrial DNA sequences of the green turtle and blue-tailed mole skink: statistical evidence for archosaurian affinity of turtles. Mol. Biol. Evol. 16 (6): 784-792.         [ Links ]

27. Lara-Ruiz P., Lopez G., Santos F., Soares L. (2006) Extensive hybridization in hawksbill turtles (Eretmochelys imbricata) nesting in Brazil revealed by mDNA analyses. Conservation Genetics 7: 773-781.         [ Links ]

28. Leroux R.A., Dutton H.P., Abreu-Grobois F.A., Lagueux C.J., Campbell C.L., Delcroix E., Chevalier J., Horrocks J.A., Hillis-Starr Z., Troeng S., Harrison E., Stapleton S. (2012) Re-examination of population structure and phylogeography of hawksbill turtles in the wider Caribbean using longer mtDNA sequences. J. Hered. 103 (6): 806-820.         [ Links ]

29. Limpus C.J., Gyuris E., Miller J.D. (1988) Reassessment of the Taxonomic Status of the Sea Turtle Genus Natator McCulloch, 1908, With a Redescription of the Genus and Species. Transactios of the Royal Society of South Australia Incorporated 112: 1-10.         [ Links ]

30. Liu Z.J., Cordes J.F. (2004) DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics. Aquaculture 238 (1): 1-37.         [ Links ]

31. Marquez R., del Carmen Farias M. (2000) Las tortugas marinas y nuestro tiempo. Fondo de Cultura Economica.         [ Links ]

32. Meylan A.B., Donnelly M. (1999) Status justification for listing the hawksbill turtle (Eretmochelys imbricata) as critically endangered on the 1996 IUCN Red List of Threatened Animals. Chelonian Conservation and Biology 3 (2): 200-224.         [ Links ]

33. Monzon-Arguello C., Rico C., Marco A., Lopez P., Lopez- Jurado L. (2010) Genetic characterization of eastern Atlantic hawksbill turtles at a foraging group indicates major undiscovered nesting populations in the region. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 387: 9-14.         [ Links ]

34. Monzon-Arguello C., Loureiro N., Delgado C., Marco A., Lopez J., Gomez M., Abreu-Grobois F. (2011) Principe island hawksbills: Genetic isolation of an eastern Atlantic stock. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 407: 345-354.         [ Links ]

35. Naro-Maciel E., Le M., FitzSimmons N.N., Amato G. (2008) Evolutionary relationships of marine turtles: a molecular phylogeny based on nuclear and mitochondrial genes. Mol. Phylo. Evol. 49 (2): 659- 662.         [ Links ]

36. Nei M., Kumar S. (2000) Molecular evolution and phylogenetics. Oxford University Press.         [ Links ]

37. Pritchard P.C.H. (1999) Status of the black turtle. Conserv. Biol. 13: 1000-1003.         [ Links ]

38. Revuelta O., Tomas J. (2010) Tortuga carey–Eretmochelys imbricata (Linnaeus, 1766). En: Salvador A., Marco A. (Eds.) Enciclopedia Virtual de los Vertebrados Espanoles. Museo Nacional de Ciencias Naturales, Madrid.

39. Shamblin B.M., Bjorndal K.A., Bolten A.B., Hillis-Starr Z.M., Lundgren I., Naro-Maciel E., Nairn C.J. (2012) Mitogenomic sequences better resolve stock structure of southern Greater Caribbean green turtle rookeries. Mol. Ecol. 21 (10): 2330-2340.         [ Links ]

40. Tabib M., Zolgharnein H., Mohammadi M., Salari- Aliabadi M.A., Qasemi A., Roshani S., Rajabi-Maham H., Frootan F. (2011) mtDNA variation of the critically endangered hawksbill turtle (Eretmochelys imbricata) nesting on Iranian islands of the Persian Gulf. Gen. Mol. Res. 10 (3): 1499-1503.         [ Links ]

41. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. (2011) MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28 (10): 2731-2739.         [ Links ]

42. Troeng S., Dutton P., Evans D. (2005) Migration of hawksbill turtles Eretmochelys imbricata from Tortuguero, Costa Rica. Ecography 28: 394-402.         [ Links ]

43. Trujillo-Arias N., Amorocho D.F., Lopez-Alvarez D., Mejia-Ladino L.M. (2014) Relaciones filogeograficas de algunas colonias de alimentacion y anidacion de la tortuga carey (Eretmochelys imbricata) en el Pacifico y Caribe Colombianos. Bol. Invest. Mar. y Cost. 43: 159- 182.         [ Links ]

44. Velez-Zuazo X., Ramos W.D., van Dam R.P., Diez C.E., Abreu-Grobois A., McMillan W. (2008) Dispersal, recruitment and migratory behavior in a hawksbill sea turtle aggregation. Mol. Ecol. 17 (3): 839-853.         [ Links ]

45. Willems M., Tahiri N., Makarenkov V. (2014) A new efficient algorithm for inferring explicit hybridization networks following the Neighbor-Joining principle. J. Bioinf. Comput. Biol. 12 (5): 1450024.         [ Links ]

46. Zangerl R., Hendrickson L.P., Hendrickson J.R. (1988) A redescription of the Australian flatback sea turtle, Natator depressus. Bishop Museum Press.         [ Links ]