ARTÍCULO ORIGINAL

Administración de dosis elevadas de vitamina E en ratas adultas con síndrome metabólico experimental: efecto sobre el estrés oxidativo

Administration of high doses of vitamin E in adult rats with experimental metabolic syndrome: effect on oxidative stress

 

Wallinger ML¹ ; Rosón M¹ ; Ricci C²; Linares LM³; Reyes Toso, CF⁴

¹ Licenciada en Nutrición
² Licenciado en Biología
³ Médica
⁴ Doctor en Medicina
Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Escuela de Nutrición. Departamento de Fisiología. Laboratorio de Reactividad Vascular

Correspondencia: creyestoso@intramed.net

Recibido: 28 de marzo 2011.
Aceptado en su versión corregida: 30 de mayo 2011.

 

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Resumen

Introducción: El consumo crónico de fructosa en ratas induce la producción de síndrome metabólico. Objetivo: Evaluar en el Síndrome Metabólico Experimental (entendido como la presencia de al menos 3 de los parámetros alterados), el efecto de la administración de vitamina E sobre el nivel de lipoperoxidación en el plasma y en los tejidos.
Materiales y métodos: Se estudiaron ratas Wistar machos, divididas en 4 grupos: a) control (C); b) control suplementadas con vitamina E (CvE); c) fructosa (F); d) fructosa suplementadas con vitamina E (FvE). Las dietas fueron elaboradas según las indicaciones de American Institute of Nutricion del año 1993 (AIN 93), reemplazándose en los grupos F y FvE parcialmente la fuente de carbohidratos. Se suplementó a los grupos CvE y FvE con 50 mg/día de vitamina E acetato (1360 IU/g). Se controlaron periódicamente: glucemia basal, glucemia post-prandial, prueba de tolerancia oral a la glucosa (PTOG), insulinemia, trigliceridemia, colesterolemia y presión arterial, para comprobar la aparición de los parámetros alterados del síndrome metabólico. Para medir el nivel de lipoperoxidación se determinaron las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) en plasma y tejidos. Análisis estadístico: test T y ANOVA.
Resultados: Se comprobó la presencia de síndrome metabólico en el 100 % de las ratas estudiadas. Los TBARS en plasma (microlmol/l) (F vs FvE) arrojaron los siguientes resultados: 2,203 ± 0,142 vs 1,836 ± 0,05818, y 2,265 ± 0,1040 vs 1,915 ± 0,05506 a las 6 y 14 semanas respectivamente (p<0,05) ; TBARS en corazón (nanomol/ gr de proteína) (F vs FvE): 137,6± 5,187 vs 104,7 ± 8,277 (p<0,01) ;TBARS en Hígado (nanomol/ gr de proteína) (F vs FvE): 171,6 ± 8,716 vs 124,9 ± 4,575 (p< 0,001).
Conclusión: La administración de vitamina E disminuyó significativamente el nivel de lipoperoxidación tanto en plasma como en homogenatos de tejidos.

Palabras clave:Síndrome metabólico; Vitamina E; Estrés oxidativo; Lipoperoxidación; TBARS.

Abstract

Introduction: Chronic consumption of fructose in rats induces the production of metabolic syndrome. Objective: To evaluate in the Experimental Metabolic Syndrome (defined as the presence of at least 3 of the parameters altered), the effect of the administration of vitamin E on lipoperoxidation level in plasma and tissues.
Materials and methods: Male Wistar rats were studied and divided into 4 groups: a) control (C), b) control supplemented with vitamin E (CVE), c) fructose (F), d) fructose supplemented with vitamin E (FVE) . The diets were prepared following the indications of the American Institute of Nutrition AIN 93, and in the groups F and FVE the source of carbohydrates was partially replaced. The CVE and FVE groups were supplemented with 50 mg / per day of vitamin E acetate (1360 IU / g). There was continuous monitoring on the following: fasting glucose, postprandial glucose, oral glucose tolerance test (OGTT) insulin, triglycerides, cholesterol and blood pressure to check the appearance of the altered parameters of metabolic syndrome. To measure the level of lipoperoxidation the thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) were determined in plasma and tissues. Statistical analysis: t test and ANOVA.
Results: The presence of metabolic syndrome was proved in 100% of rats studied. The TBARS in plasma (microlmol / l) (F vs FVE) yielded the following results: 2,203 ± 0,142 vs. 1,836 ± 0.05818, and 2,265 ± 0.1040 vs. 1,915 ± 0.05506 at 6 and 14 weeks respectively (p <0.05) TBARS in heart (nanomole / g protein) (F vs FVE): 137.6 ± 5187 vs104.7 ± 8277 (p <0.01); TBARS in liver (nanomole / g protein) (F vs FVE): 171.6± 8,716 vs 124.9. ± 4,575 (p <0.001).
Conclusion: The administration of vitamin E significantly decreased the rate of lipoperoxidation in both plasma and tissue homogenates.

Keywords: Metabolic syndrome; Vitamin E; Oxidative stress; Lipoperoxidation; TBARS.

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Introducción

El Síndrome Metabólico (SM) ⁽¹⁾, según fue descripto por Reaven GM en el año 1988, comprende obesidad, insulino resistencia, hipertensión, tolerancia alterada a la glucosa o diabetes, hiperinsulinemia y dislipemia caracterizada por aumento de los triglicéridos y baja concentración de HDL. Todas estas características descriptas previamente, constituyen factores de riesgo para el desarrollo de aterosclerosis, y por lo tanto el SM representa un riesgo importante para padecer enfermedad coronaria.
Actualmente algunos autores incluyen al aumento de las concentraciones del activador del inhibidor de plasminógeno, de la proteína C reactiva, del factor de necrosis tumoral α junto a la disminución de la adiponectina como características del síndrome metabólico ^(2-4).
Por otro lado, el SM está asociado a un incremento del estrés oxidativo. Éste juega un rol importante en el desarrollo de las complicaciones que se presentan en el SM y la diabetes mellitus (DM) ^{(5, 6)}. La hiperglucemia provoca aumento del flujo de sustratos hacia la vía del Poliol, alteración del estado redox celular, incremento de la formación de diacilglicerol, y consecuentemente de proteína kinasa C, y aceleramiento de la formación no enzimática de productos avanzados de glucosilación ^(7,8). La activación de algunas de estas vías resulta en la formación de especies reactivas del oxígeno (ERO), como el anión superóxido (O^2-), por medio del sistema NADPH oxidasa principalmente.
Además, la hiperglucemia favorece el incremento de la enzima óxido nítrico sintasa inducible (ONSi), lo cual aumenta la producción de óxido nítrico (ON). El O^2-, al combinarse con el ON, forma peroxinitritos (ONOO^-), especie reactiva aún más "peligrosa" (O^2-+ON = ONOO^-)
Las últimas evidencias sugieren que el ONOO^- es la clave de la patogénesis de las complicaciones cardiovasculares en el SM y la DM. Al reaccionar con varias biomoléculas produce disfunción vascular por diferentes mecanismos. En trabajos recientes efectuados en células endoteliales se ha visto que el aumento de los niveles de ONOO^- daña el ADN a través de la activación de diferentes sistemas enzimáticos ⁽⁸⁾.
Desde mediados de la década del 1970 pueden encontrarse trabajos que indican que el consumo crónico de fructosa (como fructosa propiamente dicha o como sacarosa) induce insulino-resistencia tanto en ratas normales como en ratas diabéticas ⁽⁹⁾. Estudios posteriores no solo han confirmado la resistencia insulínica, sino que además han mostrado un aumento de la presión arterial sistólica, conjuntamente con un incremento en los niveles de triglicéridos y del estrés oxidativo, así como un deterioro de la producción/ secreción de insulina. Este efecto estaría relacionado con la utilización hepática de la fructosa, ya que al aumentar la producción de triglicéridos a este nivel, produciría resistencia periférica a la insulina. Además la fructosa posee una alta capacidad de formar productos avanzados de glicosilación no enzimática (AGEs), y en consecuencia aumentar la producción de ERO.
Es por este motivo que se utiliza como modelo de SM en animales de laboratorio a la administración crónica de sacarosa o fructosa (tanto en la dieta como en la bebida de las ratas), para estudiar el mecanismo de las complicaciones metabólicas y vasculares de este síndrome.
La administración de un antioxidante nutricional se ha propuesto como uno de los factores que ayudarían a prevenir el aumento del estrés oxidativo de este síndrome. En este sentido, la vitamina E actúa, por un lado favoreciendo la estabilidad de las cadenas lípídicas, y por el otro, disminuyendo el ensamble de la NADPH oxidasa responsable de la producción de las ERO. Proporcionaría, por lo tanto, una eficaz protección contra la formación de ONOO^-, disminuyendo los niveles de peroxidación lipídica ^(10,11).

Objetivo

Evaluar en el SM Experimental, el efecto de la administración prolongada de dosis elevadas de vitamina E sobre los parámetros metabólicos y la lipoperoxidación del plasma, hígado y corazón.

Materiales y métodos:

Diseño
Estudio comparativo, prospectivo, experimental, longitudinal (para las variables metabólicas, la presión arterial y los TBARS en plasma) y transversal (para los TBARS en tejidos).

Animales
Se utilizaron ratas Wistar machos que a partir de los dos meses se separaron en los diferentes grupos experimentales según el esquema que se desarrollará a continuación. Los animales se mantuvieron durante todo el tiempo que duró la experiencia (3.5 meses) bajo un régimen diario de luz de 12 horas (entre las 8:00 y las 20:00 hs). Las ratas tuvieron acceso al agua y alimento ad libitum. Se alojaron en jaulas individuales a los efectos de controlar en forma adecuada la ingesta de cada animal. Se tomaron las medidas adecuadas para minimizar el dolor o la incomodidad, según los principios y procedimientos detallados en las Directivas del Consejo de las Comunidades Europeas (86/609/EEC).

Dieta
Para estudiar los efectos metabólicos de la administración crónica de fructosa y su influencia sobre los niveles de estrés oxidativo, se separó a los animales en 4 grupos experimentales de 8 animales cada uno.
El grupo control (C) recibió una dieta de mantenimiento elaborada según las recomendaciones de la AIN93 ⁽¹²⁾ para ratas. En el grupo fructosa (F) se reemplazó parcialmente la fuente de hidratos de carbono de dicha dieta con un 60% (peso) de fructosa. Los grupos experimentales suplementados con vitamina E acetato (FvE y CvE), recibieron las dietas ya descriptas para los grupos C o F adicionadas con 50 mg/día. La composición de las diferentes dietas se presenta en la tabla 1.

Tabla 1: Composición química de las diferentes dietas.

Controles periódicos, de la presión arterial y de los parámetros metabólicos
Se controlaron periódicamente los siguientes parámetros: consumo de dieta, peso, presión arterial sistólica, perfil glucémico (glucemia en ayunas, post prandial y PTOG), perfil lipídico (colesterol total, colesterol HDL y triglicéridos) e insulinemia. Los mismos se evaluaron para comprobar la presencia de síndrome metabólico y los posibles efectos de la utilización de un antioxidante (vitamina E) sobre los mismos.
La presión arterial sistólica se midió mediante un sistema compuesto por un esfingomanómetro y una célula fotoeléctrica colocada en la cola del animal, que a su vez se conectó a un sistema de amplificación y registro por computadora.
La glucemia en ayunas se determinó luego de un ayuno de 12 hs. La glucemia post prandial se determinó a los 90 minutos de haberles retirado el alimento en animales que previamente ayunaron por 12 horas y comieron por una hora.
La muestra se tomó de la cola del animal, una vez al mes, durante todo el tiempo de trabajo. La glucemia se evaluó mediante el uso del método enzimático (glucosa oxidasa) ACCUTREND (Roche Diagnostics Ltd, Sussex, UK).
En el caso de los animales con glucemias postv prandiales normales se realizó una PTOG previo ayunov de 12 horas, suministrando por vía oral 10 ml/kg dev peso corporal de una solución que contiene 0.32 g dev glucosa por ml de agua. La glucemia se evaluó a partirv de muestras de sangre que se obtuvieron a tiempos:v 0 (previo a la administración de la solución glucosada),v 15, 30, 60 y 90 minutos.
Sobre la muestra de plasma de animales ayunados por 12 horas, se evaluaron las concentraciones de triglicéridos y colesterol total y HDL mediante el uso de reactivos enzimáticos y espectrofotómetro.
Se realizó la determinación de insulinemia en plasma mediante radio-inmunoanálisis empleando un juego de reactivos comerciales específico para rata (Linco Research, St. Louis. MO).

Determinación de TBARS
Se determinó TBARS en plasma y homogenatos de tejidos mediante la medida de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (13-15). Se incubó 0.1 ml de plasma con 0.9 ml del reactivo de fox a 37 ˚C durante 30 minutos. El tejido se homegeneizó en frío (0˚C) empleando como buffer un medio compuesto por fosfato, EDTA, Triton X, y butil-hidroxi-tolueno. Las reacciones para la determinación de sustancias reactivas con el ácido tiobarbitúrico se realizaron según las técnicas descriptas para plasma por Buege y Aust, y para tejidos por Stockes y Dormandy. Los resultados se expresaron en micromol/ l en plasma o en nanomol/g de proteína en el tejido. El contenido proteico se evalúo mediante el procedimiento de Lowry. La lectura se realizó en un espectrofotómetro a 535 nm.

Análisis estadístico
Los resultados obtenidos fueron registrados en forma manual en cuadernos y planillas para tal fin. Se almacenaron y procesaron en el programa GraphPad Prism para PC y fueron evaluados estadísticamente empleando un ANOVA de una vía al que luego se aplicó un test de comparaciones múltiples (Bonferroni). En algunos parámetros se utilizó un test "t". Se consideraron diferencias significativas aquellas que presentaron una p< 0,05 en todos los casos.

Resultados

Resultados metabólicos y presión arterial sistólica:
Los parámetros metabólicos y la presión arterial sistólica demostraron la presencia de síndrome metabólico (C vs F), como se observa en la tabla 2.

Tabla 2 : Parámetros metabólicos y presión arterial sistólica de los grupos fructosa (F) y control (C) a las 14 semanas de tratamiento (media ± ES)

La administración de vitamina E no mejoró significativamente (F vs FvE) ni la hipertensión, ni la PTOG alterada, ni los niveles de insulina, ni la hipercolesterolemia. Sin embargo, disminuyó significativamente la aparición de la hipertrigliceridemia (mmol/l) del síndrome metabólico experimental (F vs FvE: 1.439 ± 0.03701 vs 1.210 ± 0.05312; p< 0.01 a las 6 semanas y 1.395± 0.04989 vs 1.165 ± 0.03727 p<0.01 a las 14 semanas)

Medición de TBARS:
En todos los tiempos estudiados (semanas 6 y 14) los niveles de TBARS en plasma para las ratas alimentadas con fructosa fueron significativamente mayores que los controles (One way ANOVA p< 0.001; F 10.22. Los resultados del post test Bonferroni se detallan al pie de la figura). Los animales que recibieron una dieta alta en fructosa también presentaron una diferencia significativa en sus niveles de TBARS en homogenatos de tejido (corazón e hígado) con respecto a sus controles (test "t" p< 0.0001).
La administración de altas dosis de vitamina E mostró una diferencia significativa en los niveles de TBARS plasmáticos alterados por el consumo crónico de fructosa. (One way ANOVA p< 0.001; F 9.339 para la semana 6 y p<0.0001; p< 0.001; F 16.76 para las 14 semanas). La comparación entre los diferentes grupos se realizó con un post test de Bonferroni, y se detalla al pie de los gráficos. Lo mismo pudo observarse en el caso de los homogenatos de tejidos: corazón (One way ANOVA p< 0.0001; F 10.94) e hígado (One way ANOVA p< 0.0001; F 21.07) En este caso también las comparaciones entre los diferentes grupos experimentales se realizaron con un post test de Bonferroni, y se detallan al pie del gráfico correspondiente.

Gráfico 1: TBARS en plasma (micromol/l) One way ANOVA post test Bonferroni a= C vs F p< 0.001; b=F vs FvE p<0.05; c= F vs CvE p< 0.001 n= 8 animales por grupo

Gráfico 2: TBARS en plasma (micro mol/l) One way ANOVA post test Bonferroni a= C vs F p< 0.001; b= F vs FvE p<0.05; c= F vs CvE p< 0.001 n= 8 animales por grupo

Grafico 3: TBARS en corazón (nano mol/gr. de proteína) One way ANOVA post test Bonferroni a= C vs F p< 0.001; b= F vs FvE p<0.01; c= F vs CvE p< 0.001 n= 8 animales por grupo

Grafico 4: TBARS en hígado (nano mol/gr. de proteína) One way ANOVA post test Bonferroni a= C vs F p< 0.001; b= F vs FvE p<0.001; c= F vs CvE p< 0.001 n= 8 animales por grupo

Discusión

Desde mediados de la década del setenta se han utilizado en animales dietas altas en fructosa para producir SM experimental ⁽¹¹⁾. La mayor parte de los trabajos han encontrado hipertensión, tolerancia alterada a la glucosa, hipertrigliceridemia, y deterioro del equilibrio pro y anti-antioxidante ^(16-25).
Coincidentemente con los trabajos consultados, se puede observar en el presente estudio que el consumo crónico y de altas cantidades de fructosa promovió el desarrollo de SM en las ratas. Este hecho se manifiesta en la presencia de al menos 3 parámetros alterados en los animales estudiados (aumento de la presión arterial, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, hiperinsulinemia, tolerancia alterada a la glucosa)
Uno de los hallazgos característicos de este modelo es el aumento excesivo de las EROs. Este hecho es de particular relevancia porque actualmente se conoce que uno de los factores responsables del deterioro vascular de la DM y el SM, sería el aumento del estrés oxidativo ^{(7, 26-31).}
En este sentido, los mecanismos por los cuáles el consumo crónico de fructosa produciría un aumento del estrés oxidativo son diversos. Por un lado, este modelo incrementa los niveles de AGEs ⁽³²⁾ (debido a la metabolización hepática de la fructosa, y a la alta capacidad de la fructosa para reaccionar con las proteínas). Por el otro produce una resistencia a la acción de la insulina con tolerancia alterada a la glucosa (a pesar de que, como se observa en este y otros trabajos las glucemias basales y post-prandiales permanecen en valores comparables con los controles).
Este aumento del estrés oxidativo se ha observado también en pacientes diabéticos, o con tolerancia alterada a la glucosa, o en individuos con alto consumo de fructosa (como consecuencia del aumento en la ingesta de productos elaborados con sacarosa o JMAF, un aditivo alimentario utilizado por su alto poder edulcorante) ^{(26, 33-36)}.
Existen varias maneras de evaluar tanto el aumento de la producción de EROs como del deterioro del sistema antioxidante ^(37-41). Una de ellas es medir indirectamente el aumento del estrés oxidativo a través de los niveles de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico ⁽³⁹⁾, mediante las cuales se evalúa la peroxidación lipídica. Este proceso produce la destrucción de los lípidos de la membrana celular con la producción de lipoperóxidos y sus productos derivados. El malondialdehído y los hidroxialquenales son los productos finales que proceden de la ruptura de los ácidos grasos poli-insaturados. La medida de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS) es un indicador de reacciones de peroxidación lipídica, ya que determina productos finales de la reacción en cadena, principalmente malondialdehido. Desde mediados del siglo pasado varios autores han encontrado que los productos de los ácidos grasos insaturados oxidados reaccionan con el ácido tiobarbitúrico dando un compuesto de color rojo ^(13-15).
Busserolles y cols ⁽⁴²⁾ observaron aumento de los TBARS en el modelo de SM experimental en 4 semanas de experimentación. Del mismo modo, Faure y cols ⁽⁴³⁾ encontraron aumento de estas sustancias en animales sometidos por 6 semanas a una dieta con un 58.6% de fructosa. Incluso, Mohanty y cols ⁽²⁶⁾ han observado este fenómeno en pacientes a los que se les suministró glucosa en altas dosis y a los cuales se les midieron los TBARS a las pocas horas. Coincidentemente con la bibliografía ^{(26, 42-44)}, se observa en los animales empleados en el presente estudio un aumento de la producción de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico tanto en el plasma como en los tejidos (cardíaco y hepático). Esta diferencia es significativa para los tiempos estudiados, lo cual demuestra que en este modelo de síndrome metabólico experimental se encuentra aumentada la producción de EROs.
Existen en la actualidad pocos trabajos que hayan evaluado los efectos de la administración de un antioxidante nutricional, sobre todo por un período de tiempo prolongado y suministrándolo de manera fisiológica (formando parte de la dieta de los animales).
Por ejemplo, Faure y cols ⁽⁴³⁾, han encontrado los mismos efectos benéficos del agregado de vitamina E en un período menor de tiempo, pero empleando una dosis mayor (3.4 g/kg de dieta u 85 mg/día).
En el presente estudio, la administración prolongada de vitamina E en altas dosis en la dieta disminuye significativamente los niveles de peroxidación lipídica, tanto en el plasma como en los homogenatos de tejido. De hecho, se observa que los valores obtenidos en los animales suplementados con vitamina E son comparables con los de animales que recibieron dietas control. Este hecho es importante, ya que una de las principales causas del deterioro endotelial presente en el SM y la DM es el aumento del estrés oxidativo. Otros trabajos realizados en animales de laboratorio coinciden con nuestros resultados ^{(43, 45)}, ya sea que hayan utilizado vitamina E u otro antioxidante nutricional o farmacológico ^(42,45). Por el contrario, los resultados en los ensayos clínicos ^{(40, 46-53)} no son uniformes, pero tampoco lo son las variables que evalúan: edad, tiempo de progresión de la enfermedad, dosis y tiempo de administración de la vitamina, presencia o no de complicaciones, otros hábitos o patologías asociadas. Esto hace que no puedan sacarse conclusiones o recomendaciones generales de los beneficios de la administración de vitamina E en los humanos.
Se puede concluir que la administración de altas dosis de vitamina E en el modelo de síndrome metabólico experimental por el consumo de fructosa en las ratas, disminuye significativamente los niveles de estrés oxidativo. Demuestra este hecho el poder antioxidante de la vitamina E y su posible efecto protector sobre el deterioro vascular del SM y la DM.

Referencias bibliográficas

1. Dandona P; Aljada A; Chaudhuri A; Mohanty P; Garg R. Metabolic Syndrome: A comprehensive perspective based on interactions between obesity, diabetes and inflammation. Circulation. 2005; 111: 1448-1454.         [ Links ]

2. Dhindsa S; Tripathy D; Mohanty P; Ghanim H; Syed T; Aljada A; Dandona P. Differentiel effects of glucose and alcohol on reactive oxygen species generation and intranuclear nuclear factor ?ß in mononuclear cells. Metabolism. 2004; 53: 330-334.         [ Links ]

3. Aljada A; Ghanim H; Mohanty P; Tufail S; Bandyopadhyay A; Dandona P. Glucose intakes induce an increase in AP-1 and Egr-1 binding activities and tissue factor and matrix metalloproteinase concentration. Am J Clin Nutr. 2004; 80: 51-57.         [ Links ]

4. Aljada A; Mohanty P; Ghanim H; Abdo T; Tripathy D; Chaudhuri A; Dandona P. Increase in intranuclear nuclear factor ?ß and decrease in inhibitor ?ß in mononuclear cells after a mixed meal: evidence for a proinflammatory effect. Am J Clin Nutr. 2004; 79: 682-690.         [ Links ]

5. Wassmann S; Wassmann K; Nickenig G. Modulation of oxidant and antioxidant enzyme expresion and function in vascular cells. Hypertension. 2004; 44: 381-386.         [ Links ]

6. Pacher P; Szabó C. Role of peroxynitrite in the pathogenesis of cardiovascular complications of diabetes. Current Opinion in Pharmacology. 2006; 6: 136-141.         [ Links ]

7. Ceriello A. New insights on oxidative stress nad diabetic complications may lead to a "causal" antioxidant therapy. Diabetes Care. 2003; 26: 1589-1596.         [ Links ]

8. Guzik T; Mussa S; Gastaldi D; Sadowski J; Ratnatunga C; Pillai R; Channon K. Mecanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NADPH oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 2002; 105: 1656-1662.         [ Links ]

9. Brigelius-Flohé R; Kelly F; Salonen J; Neuzil J; Zingg JM; Azzi A. The european pesrspective on vitamin E: current knowledge and future research. Am J Clin Nutr. 2002; 76: 703-716.         [ Links ]

10. Cohen A; Teitelbaum; Rosenman E. Diabetes induced by high fructose diet. Metabolism. 1977; 26 (1): 17-24.         [ Links ]

11. Munteanu A; Zingg JM; Azzi A. Anti-atherosclerotic effects of vitamin E- myth or reality? J Cell Mol Med. 2004; 8 (1): 59-76.         [ Links ]

12. Bernheim F; Bernheim M; Wilbur K. The reaction between thiobarbituric acid and the oxidation products of certain lipides. J Biol Chem. 1948; 174: 257-264.         [ Links ]

13. Reeves P; Nielsen F; Fahey G. AIN 93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet. J. Nutr. 1993; 1939-1951.         [ Links ]

14. Ohkawa H; Ohishi N; Yagi K. Reaction of linoleic acid hydroperoxide with tiobarbituric acid. Journal of Lipid Research. 1978; 19: 1053-1057.         [ Links ]

15. Esterbauer H; Cheeseman K; Dranzani M; Polo G; Slater T. Separation and characterization of the aldehidic products of lipid peroxidation stimulated by ADP-Fe in rat liver microsomes. J Biochem. 1982; 208: 129-140.         [ Links ]

16. Delbosc S; Paizanis E; Magous R; Araiz C; Dimo T; Cristol JP; Cros G; Azay J. Involvement of oxidative stress and NADPH oxidase activation in the development of cardiovascular complications in a model of insuline resistance, the fructose-fed rats. Atherosclerosis. 2005; 179: 43-49.         [ Links ]

17. Hsieh PS. Attenuation of insulin-mediated pressor effect and nitric oxide release in rats with fructoseinduced insulin resistance. Am J of Hypertension. 2004; 17: 707-711.         [ Links ]

18. Verma S; Bhanot S; Yao L; Mc Neil J. Defective endothelium-dependent relaxation in fructosehypertensive rats. Am J of Hypertension. 1996; 9: 370-376.         [ Links ]

19. Verma S; Bhanot S; Mc Neil J. Antihypertensive effects of metformin in fructose-fed hyperinsulinemic, hypertensive rats. J Pharm Exp Therap. 1994; 271: 1334-1337.         [ Links ]

20. Ruzzin J; Lai Y; Jensen J. Consumption of carbohydrate solutions enhances energy intake without increased body weight and impaired insulin action in rat skeletal muscle. Diabetes Metab. 2005; 31 (2): 178-188.         [ Links ]

21. Joyeux-Faure M; Rossini E; Ribout C; Faure P. Fructosefed rat hearts are protected against ischemia-reperfusion injury. Exp Biol Med. 2006; 231: 456-462.         [ Links ]

22. D´Angelo Q; Elmarokby A; Pollack D; Stepp D. Fructose feeding increases insulin resistance but not blood pressure in Sprague-Dawley rats. Hypertension. 2005; 46: 806-811.         [ Links ]

23. Suzuki T; Haro H. Ingestion of guar gum hydrolysate, a soluble and fermentable nondigestible saccharide, improves glucose intolerance and prevents hypertrygliceridemia in rats fed fructose. J Nutr. 2004; 134: 1942-1947.         [ Links ]

24. Bhanot S; Mc Neil J; Bryer-Ash M. Vanadyl sulfate prevents fructose-induced hyperinsulinemia and hypertension in rats. Hypertension. 1994; 23: 208-312.         [ Links ]

25. Anitha Nandhini A; Thirunavukkarasu V; Anuradha C. Taurine modifies insulin signaling enzimes in the fructosefed insulin resistant rats. Diabetes Metab. 2005; 31: 337- 344.         [ Links ]

26. Mohanty P; Hamouda W; Garg R; Aljada A; Ghanim H; Dandona P. Glucose challenge stimulates reactive species (ROS) generation by leucocytes. J Clin Endocrinol Metab. 2000; 85: 2970-2973        [ Links ]

27. Calles-Escandon J; Cipolla M. Diabetes and endothelial dysfunction: a clinical perspective. Endocrine Reviews. 2001; 22: 36-52.         [ Links ]

28. Pacher P; Szabó C. Role of peroxynitrite in the pathogenesis of cardiovascular complications of diabetes. Current Opinion in Pharmacology. 2006; 6: 136-141.         [ Links ]

29. Spitaler M; Graier W. Vascular tergets of redox signaling in diabetes mellitus. Diabetología. 2002; 45: 476-494.         [ Links ]

30. Rolo A; Palmeira C. Diabetes and mitocondrial function: role of hyperglycemia and oxidative stress. Toxicol and Applied Pharmacology. 2006; 212: 167-178.         [ Links ]

31. Laight D; Carrier M; Anggard E. Antioxidants, diabetes and endothelial dysfunction. Cardiovasc Res. 2000; 47: 457-464.         [ Links ]

32. Schalkwijk C; Stehouwer C; van Hinsbergh V. Fructosemediated non-enzimatic glycation: sweet coupling or bad modification. Diabetes Metab Res Rev. 2004; 20: 369-382.         [ Links ]

33. Dandona P; Mohanty P; Hamouda W; Ghanim H; Aljada A; Garg R; Kumar V. Inhibitory effect of a two day fast on reactive oxygen species (ROS) generation by leucocytes and plasma ortho-tyrosine and metatyrosine concentrations. J Clin Endocrinol Metab. 2001; 86: 2899-2902.         [ Links ]

34. Guzik T; Mussa S; Gastaldi D; Sadowski J; Ratnatunga C; Pillai R; Channon K. Mecanisms of increased vascular superoxide production in human diabetes mellitus: role of NADPH oxidase and endothelial nitric oxide synthase. Circulation. 2002; 105: 1656-1662.         [ Links ]

35. Ceriello A; Taboga C; Tonutti L; Quagliaro L; Piconi L; Bais B; Da Ros R; Motz E. Evidence for an independent and cumulative effect of postprandial hyperglyceridemia and hyperglycemia on endothelial dysfunction and oxidative stress generation: effects of short and long-term simvastatin treatment. Circulation. 2002; 106: 1211-1218.         [ Links ]

36. Ceriello A; Quagliaro L; Catone B; Pascon R; Piazzola M; Bais B; Marra G; Tonutti L; Taboga C; Motz E. Role of hyperglycemia in nitrityrosine postprandial generation. Diabetes Care. 2002; 25: 1439-1443.         [ Links ]

37. Ceriello A; Mercuri F; Quagliaro L; Assaloni R; Motz E; Tonutti L; Taboga C. Detection of nitrotyrosine in diabetic plasma: evidence of oxidative stress. Diabetología. 2001; 44: 834-838.         [ Links ]

38. Wigg S; Tare M; Forbes J; Cooper M; Thomas M; Coleman H; Parkington H; Brien R. Early vitamin E supplementation attenuates diabetes-associated vascular dysfunction and the rise in protein kinase C-ß in mesenteric artery and ameliorates wall stiffness in femoral artery of Wistar rats. Diabetologia. 2004; 47: 1038-1046.         [ Links ]

39. Cinar M; Ulker S; Alper G; Evinc A. Effect of dietary vitamin E supplementation on vascular reactivity of thoracic aorta in streptozotocin-diabetic rats. Pharmacology. 2001; 62: 56-64.         [ Links ]

40. Paolisso G; Tagliamonte R; Barbieri M; Zito G; Gambardella A; Varricchio G; Ragno E; Varrichio M. Chronic vitamin E administration improves brachial reactivity and increases intracelullar magnesium concentration in type 2 diabetic patients. J Clin Endocrinol Metab. 2000; 85: 109-115.         [ Links ]

41. Oudot A; Behr-Roussel D; Compagnie S; Caisey S; Le Coz O; Gorny D; Alexandre L; Giuliano F. Endothelial dysfunction in insulin-resistance rats is associated with oxidative stress and COX pathway dysregulation. Physiol Res. 2009; 58:499-509.         [ Links ]

42. Busserolles J; Gueux E; Rock E; Demigné C; Mazur A; Rayssiguier Y. Oligofructose protects against the hypertriglyceridemia and pro-oxidative effects of a high fructose diet in rats. J Nutr. 2003; 133: 1903-1908.         [ Links ]

43. Faure P; Rossini E; Lafond JL; Richard MJ; Favier A; Halimi S. Vitamin E improves the free radical defense system potential and insulin sensitivity of rats fed high fructose diets. J Nutr. 1997; 127: 103-107.         [ Links ]

44. Delbosc S; Paizanis E; Magous R; Araiz C; Dimo T; Cristol JP; Cros G; Azay J. Involvement of oxidative stress and NADPH oxidase activation in the development of cardiovascular complications in a model of insuline resistance, the fructose-fed rats. Atherosclerosis. 2005; 179: 43-49.         [ Links ]

45. Van Tits Lambertus; Demacker P; Graaf J; Hak-Lemmers H; Stalenhoef A. a tocopherol supplementation decreases production of superoxide and cytokines by leucocytes ex vivo in both normolipidemic and hypertruglyceridemic individuals. Am J Clin Nutr. 2000; 71: 458-464.         [ Links ]

46. Rapola J; Virtamo J; Haukka J. Effect of vitamin E and beta-carotene on the incidence of angina pectoris. JAMA.1996; 275: 693-698.         [ Links ]

47. Stephens N; Parsons A; Schofied P; Kelly F; Cheeseman K; Mitchinson M. Randomised controlled trial of vitamin E patiens with coronary disease: Cambridge Heart Antioxidant Study (CHAOS). Lancet. 1999; 347:781-786.         [ Links ]

48. GISSI- Prevenzione investigators. Dietary supplementation with n-3 polyunsaturated fatty acids and vitamin E after myocardial infarction: results of the GISSI-Prevenzione trial. Gruppo italiano per lo studio della sopravivenza nell´infarto miocardico. Lancet. 1999; 354: 447-455.         [ Links ]

49. The HOPE study investigators. Vitamin E supplementation and cardiovascular events in high-risk patients. N Eng J Med. 2000; 342: 154-160.         [ Links ]

50. Boaz M; Smetana S; Weinstien T. Secondary prevention with antioxidant of cardiovascular disease in endstage renal disease (SPACE): randomised placebo-controled trial. Lancet. 2000; 256: 1213-1218.         [ Links ]

51. Salonen J; Nyyssonen K; Salonen R. Antioxidant supplementation in atherosclerosis prevention (ASAP) study: a randomized trial on the effect of vitamin E and C on 3-year progression of carotid atherosclerosis. J Intern Med. 2000; 248:377-386.         [ Links ]

52. Economides P; Khaodhiar L; Caselli A; Caballero E; Keenan H; Bursell SE; King G; Johnstone M; Horton E; Veves A. The effect on vitamin E on endothelial function of micro- and macrocirculation and left ventricular function in type 1 and type 2 diabetic patients. Diabetes. 2005; 54: 204-211.         [ Links ]

53. Manning P; Sutherland W; Walker R; Williams S; Jong S; Ryalls A; Berry E. Effect of high-dose vitamin E on insulin resistance and associated parameters in overweight subjects. Diabetes Care. 2004; 27 (9): 2166-2171.         [ Links ]