INTRODUCCIÓN

Las bacterias del género Legionella son integrantes naturales de la comunidad microbiana de agua dulce. Son microorganismos heterótrofos, que se encuentran en una gran variedad de ambientes acuáticos y en biofilms relacionados a ellos. Pueden sobrevivir en un amplio intervalo de condiciones físico-químicas, se multiplican entre 20 y 45°C y se destruyen a 70°C. Los productos utilizados en la etapa de desinfección de agua, como cloro, hipoclorito y dióxido de cloro, son efectivos para la remoción de estos microorganismos, que poseen la capacidad de sobrevivir como parásito intracelular de amebas y ciliados, en ambientes con bajas condiciones de nutrientes y como células viables no cultivables (VNC)¹-⁵.

A partir del ambiente Legionella puede pasar a colonizar los sistemas de abastecimiento de las ciudades. A través de la red de distribución llega a los hogares y se Incorpora a la instalación domiciliaria y a los tanques de almacenamiento de agua potable u otros sistemas que requieren agua para su funcionamiento, como las torres de refrigeración. El estancamiento del agua y la presencia de lodos y materia orgánica construyen una biocapa, que permite la multiplicación de la bacteria. La trasmisión de este microorganismo se produce por la inhalación de aerosoles generados por fuentes contaminadas²,⁵,⁶.

El género Legionella pertenece a la familia Legionella-ceae, conformada por 54 especies, de las cuales 25 están relacionadas a enfermedad humana⁵. Más de la mitad de las especies causan patología en el hombre, pero L. pneumophila origina más del 90% de las infecciones y fue relacionada por primera vez a cuadros de neumonía en 1977. Dentro de esta especie el serogrupo 1 es el agente etiológico del 80% de los casos de legionelosis. En Australia, Nueva Zelanda y Japón los casos de infección reportados por L. longbeachae ocurren con la misma frecuencia que los de L. pneumophila⁷ . Las infecciones por Legionella pueden presentarse como casos esporádicos o bien como brotes, pero en ambas circunstancias resulta difícil determinar la fuente de infección⁸,⁹.

La legionelosis afecta particularmente a personas con el sistema inmune debilitado o de edad avanzada. Se reconocen dos formas clínicas diferenciadas: la infección pulmonar o “enfermedad del legionario” y la forma no neumónica o “fiebre de Pontiac”. La infección por este microorganismo puede originarse en el ámbito hospitalario o en el comunitario²,¹⁰.

Las infecciones por este microorganismo son un importante problema de salud pública en Estados Unidos y Europa. Registran un aumento de casos en los últimos años y han originado brotes tanto en la comunidad como asociados a hospitales y hoteles. En 2014 se reportaron 4486 casos de legionelosis en Estados Unidos y en 2015 se notificaron 7034 en el sistema europeo¹¹-¹³. Las posibles razones de este aumento de casos se atribuyen a: 1) un aumento continuo en los sistemas de ingeniería de agua adecuados para el desarrollo de Legionella, como las instalaciones de refrigeración; 2) el envejecimiento de la sociedad en los países desarrollados; y 3) un mejor diagnóstico y reporte³. En Latinoamérica, en general, y en Argentina, en particular, existe poca información de la incidencia de Legionella spp., situación posiblemente atribuible a la presentación en forma de casos esporádicos y no de brotes. En Argentina se reporta una incidencia del 2% de todas las neumonías¹⁴-¹⁷.

Los estándares de calidad del agua destinada al consumo humano no consideran la potencial presencia de Legionella. En Argentina los requisitos de aptitud microbiológica están establecidos por su Código Alimentario, pero los análisis de Escheríchiacoli o de coliformes evalúan la contaminación fecal y no constituyen indicadores adecuados de la presencia o ausencia de este patógeno, cuya vía de infección es respiratoria²,¹⁸.

El aislamiento de Legionella en cultivo es la técnica de referencia, para la cual existen varios ensayos, como las normas de la Organización Internacional de Normalización ISO 11731/2017 y de la Organización Francesa de Normalización AFNOR 431/2017. Es el único método que permite detectar cualquier especie y serogrupo y la realización de estudios posteriores como inmunofluorescencia, aglutinación o amplificación específica mediante técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)⁹,¹⁹.

El estudio del nicho ecológico de Legionella es el primer paso para abordar el control de sudiseminación y la prevención de legionelosis en Argentina, lo cual requiere implementar la normativa internacional en relación con este tema¹⁹,²⁰.

La provincia del Chaco se encuentra ubicada en el noreste de la República Argentina. Su clima es subtropical, con estación seca al oeste y sin ella al este. Resistencia es la capital y cabecera del departamento San Fernando, cuenta con 110 180 hogares, de los cuales 95 548 (86,7%) están conectados a la red pública de agua potable. La ciudad está ubicada al sudeste de la provincia (Figura 1) y es la más poblada, según el último registro de 2010 del Instituto Nacional de Estadísticas y Censos (INDEC)²¹ cuenta con 290 723 habitantes. La ciudad capital se abastece de agua a partir de una fuente superficial denominada Riacho Barranqueras, brazo del río Paraná. Antes de ser distribuida por la red pública el agua de la fuente superficial se somete a un tratamiento convencional, que consiste en coagulación, floculación, sedimentación, filtración y desinfección²².

FIGURA 1 

La hipótesis formulada consideró que existen especies del género Legionella en los sistemas de almacenamiento domiciliario de agua potable de la ciudad de Resistencia.

El objetivo del trabajo fue evaluar la presencia de especies de Legionella en reservorios domiciliarios de agua potable de la capital chaqueña.

MÉTODOS

El diseño planteado para el trabajo fue observacional y descriptivo, con recolección prospectiva de datos. La variable seleccionada fue Legionella, para la cual se definieron dos categorías: presencia o ausencia del microorganismo.

El muestreo fue no probabilístico por conveniencia, tratando de incluir diferentes barrios de la ciudad. Para ello se trazó una cuadrícula establecida por la plaza principal y las cuatro avenidas que nacen de ella (ver Figura 2). Se analizó el agua potable procedente de los depósitos domiciliarios de la ciudad de Resistencia, donde el 86,7% de las viviendas reciben el suministro por la red pública.

FIGURA 2 Sectorización del área de estudio de la ciudad de Resistencia, Chaco, e identificación de los sitios de muestreo 

La unidad de análisis fue la muestra de 1 litro procedente de los reservorios domiciliarios de agua potable. Se incluyeron las muestras provenientes de tanques de almacenamiento de agua alimentados por la red pública y tomadas de grifos no utilizados durante las 12-24 horas previas al muestreo. Se excluyeron las muestras procedentes de grifos conectados directamente a la red pública.

El muestreo se realizó entre los meses de abril de 2015 y diciembre de 2016. La detección de Legionella en las muestras de agua se efectuó por cultivo según lo establecido en la norma ISO 11731:1998. En cada vivienda se seleccionó el grifo conectado directamente al tanque de almacenamiento que no hubiera sido utilizado durante las 12-24 horas previas. En cada punto se tomó el primer litro de agua en recipiente estéril; este fue transportado a temperatura ambiente al laboratorio, donde se inició el procesamiento de manera inmediata.

Las muestras se concentraron por filtración, usando membranas de 0,45pm. Posteriormente las membranas se transfirieron a 10 ml de buffer Ringer 1:40 y se agitaron durante 2 minutos convórtex. Se sembraron alícuotas de 0,5 ml en placas del medio selectivo preparado, adicionando cisteína, glicina, vancomicina, polimixina B y cicloheximida (suplementos SR0110A y SR0152E Oxoid) al agar Buffered Charcoal Yeast Extract (BCYE, Oxoid). Paralelamente, otra alícuota de 0,5 ml se sometió a tratamiento térmico (50°C durante 30 minutos) y se sembró en el mismo medio. Se utilizó como control positivo una muestra de agua inoculada con la cepa Legionella pneumophilasubsp. pneumophila (American Type Culture Collection, ATCC® 33152 ^TM ). Las placas se incubaron durante 7 días a 36°C. En aquellos casos en los que se evidenció desarrollo bacteriano, se seleccionaron colonias características que fueron subcultivadas a 36°C durante 2 días, en agar BCYE con y sin cisteína (suplementos SR0110A y SR0175A Oxoid)¹,⁹,²³,²⁴.

Se definió como muestra positiva aquella en la cual se recuperaron cepas que en el subcultivo desarrollaron en el agar BCYE con cisteína y no desarrollaron en el medio sin cisteína, las que se identificaron como Legionella spp. acorde a la normativa internacional. Estas fueron sometidas a estudios moleculares, PCR en tiempo real, para su confirmación de género y especie.

La técnica molecular de PCR en tiempo real con colorante intercalante (Syber Green), qPCR, se aplicó a los aislamientos identificados como Legionella spp. La preparación de los templados para el estudio molecular se realizó a partir de las cepas recuperadas de cultivo mediante el calentamiento a 100°C durante 15 minutos (técnica de boiling)en buffer Ringer 1:40. La suspensión obtenida se centrifugó a fin de eliminar los detritos celulares, y el sobrenadante se almacenó a -20°C hasta su estudio. Las secuencias diana utilizadas para la identificación de Legionella correspondieron a fragmentos conservados del gen 23S rRNA, para la confirmación del género, y el gen mip específico para la especie L. pneumophila. Los cebadores utilizados fueron los descriptos por Nazarian¹². Se utilizó la cepa L. pneumophila subsp. pneumophila (ATCC® 33152^TM) como control positivo⁸,¹².

RESULTADOS

Se analizaron 46 muestras de los depósitos domiciliarios de agua potable de Resistencia.Este número representó el 0,03% de los hogares conectados a la red pública de la ciudad. En 16 (34,8%) de las muestras se aislaron colonias de Legionella spp. (ver Figura 2). El rango de concentraciones encontradas en ellas, expresadas en unidades formadoras de colonias por litro(UFC/L), fue de 40 UFC/L a 1,4x10³UFC/L. En todos los cuadrantes en los que se dividió la ciudad se aislaron cepas de Legionella spp. En la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos en los cuadrantes de la ciudad de Resistencia.

TABLA 1 Distribución y frecuencia de las muestras de depósitos domiciliarios positivas para Legionella spp. en la ciudad de Resistencia, Chaco 

A partir de los cultivos positivos, se prepararon templados de ADN de diferentes aislamientos, que luego se identificaron por qPCR. El análisis de estos templados confirmó la presencia de Legionella pneumophila en 15 (93,75%) de las 16 muestras positivas por cultivo, y 2 (12,5%) también resultaron positivas para otras especies del género Legionella. En 1 muestra (6,25%) sólo se confirmó el género de los aislamientos.

DISCUSIÓN

La presencia de L. pneumophila y otras especies de Legionella en muestras ambientales se reporta en diferentes países. Entre las fuentes estudiadas se encuentran los sistemas de distribución y almacenamiento de agua potable y los de distribución de agua caliente¹,³,⁵. En este estudio, que se llevó a cabo en Resistencia, se determinó un 34,8% de muestras positivas para L. pneumophila y se confirmó a esta especie como la más frecuente en los reservorios domiciliarios analizados. Valores próximos al encontrado reporta Kruse²⁵, que determina 32,7% de muestras positivas para Legionella spp en diferentes puntos del sistema de distribución de agua de edificios de Colonia, Alemania. En cambio, Wang²⁶ consigna 2% de muestras positivas para Legionella spp en la evaluación de dos sistemas de distribución de agua potable en Estados Unidos. En Israel, Rodríguez-Martínez⁴ detecta 71% de muestras positivas en el sistema de distribución de agua de KiryatTivon. En los estudios sobre otra clase de muestras ambientales, sistemas de distribución de agua caliente, también se reporta la presencia de este patógeno. Serrano-Suárez¹ consigna 27% de muestras positivas para L. pneumophila en el sistema de agua caliente de hoteles de Cataluña, España. Mientras tanto, en Italia, Bonetta¹¹ encuentra 42% de muestras positivas para la especie pneumophila en hoteles y Borella²⁷, un 22,6% de positividad para Legionella spp en sistemas domiciliarios de distribución de agua caliente. En Alemania, Dilger²⁰ reporta 20,7% en los sistemas de agua caliente domiciliaria de diferentes distritos de ese país. Los datos hallados en este trabajo y en los citados previamente demuestran la capacidad de este patógeno de colonizar y desarrollarse en diversos sistemas de conducción y almacenamiento de agua.

En diferentes países de Latinoamérica se investigó y se reportaron casos de neumonía por Legionella. En Argentina existe controversia en relación con la circulación de este microorganismo. Trabajos publicados sobre agentes etiológicos de neumonía adquirida en la comunidad describen pocos casos producidos por este patógeno, con una incidencia del 2%. Sin embargo, un brote nosocomial de infección respiratoria por Legionella ocurrido en un hospital de la provincia de Buenos Aires en 2013 pone en alerta ante la posibilidad de emergencia de este patógeno¹⁵-¹⁷,²⁸. La baja incidencia de casos podría ser la causa de la falta de estudios de los reservorios ambientales de Legionella en el país. En un trabajo previo, este grupo de investigación detectó la presencia de bacterias pertenecientes al género Legionella en muestras ambientales sin lograr la identificación de especies²⁹. En las bases de datos consultadas no se encontraron otros trabajos publicados relacionados con la presencia o ausencia de esta bacteria en sistemas de distribución y almacenamiento de agua o en sistemas de refrigeración en el país. A nivel regional, sólo se conoce el estudio realizado sobre este microorganismo en muestras ambientales en Brasil. En la ciudad de Río de Janeiro, Ferreira³⁰ determinó la presencia de L. pneumophila en el sistema de agua de 5 de los 16 hospitales estudiados y en San Pablo Carvalho³¹ también detectó este patógeno en tanques de las torres de refrigeración.

Países de la Comunidad Económica Europea, Estados Unidos, Canadá y otros cuentan con normativa destinada a la investigación sistemática de Legionella spp en el agua potable. En ella se contempla el valor umbral de UFC/L a partir del cual las autoridades de salud deben iniciar medidas de descontaminación del sistema de agua¹⁹,²⁰,³². Incluso la colonización y persistencia de bajas concentraciones de Legionella en los sistemas de agua se relacionaron a brotes de legionelosis en Estados Unidos³³. Argentina carece de tal normativa, pero las concentraciones determinadas en este trabajo, del orden de 40 UFC/L a 1,4 x10³ UFC/L, son similares a las reportadas por otros autores y revelan el riesgo para la salud de la población expuesta a estas fuentes ambientales⁴,¹⁹,²⁰. Los recuentos determinados podrían ser aún mayores, dado que los agentes químicos utilizados en el proceso de desinfección del agua pueden inducir el paso de la célula bacteriana al estado de VNC, con lo cual ya no se detectan por cultivo³⁴. Lo antes expuesto y los hallazgos de Juárez³⁵ vinculados a patógenos parasitarios y virales en agua de consumo en la provincia de Salta coinciden en la necesidad de actualizar la normativa de calidad de agua vigente en Argentina.

Como en otras partes del mundo, no se logró relacionar los resultados de este trabajo con los cuadros clínicos producidos por el patógeno³. La incidencia de Legionella spp. como causal de neumonía en la población de la ciudad de Resistencia se desconoce, situación que se podría atribuir a que no se realiza la búsqueda sistemática de este patógeno en muestras clínicas, y coincide con lo reportado en el país por otros autores¹⁶,¹⁷.

La presencia simultánea de L. pneumophila y otras especies no pneumophila en una muestra de agua, que en este trabajo representa un 6,5%, también fue reportada por Buse⁵ y Dilger²⁰. No es un evento habitual, pero contribuye al incremento de la concentración bacteriana de este género en el sistema de agua y no debe ser ignorado. Los sistemas de agua se colonizan por una misma especie, y la presencia de otras denota las complejas interacciones entre microbioma, desinfectantes, temperatura, flujo del agua y composición de los biofilms, entre otros factores⁵,²⁰. La detección de Legionella en todos los cuadrantes de la ciudad justifica incluir en futuras líneas de investigación el estudio de la fuente del agua del sistema de distribución, considerando el tipo de desinfección que se realiza y la existencia de puntos de redosificación que aseguren un efecto residual hasta el extremo de la red y de los respectivos biofilms. Paralelamente se debería incluir la determinación de cloro libre residual al momento del muestreo y encuestas a los dueños sobre frecuencia y modo de la limpieza de los reservorios domiciliarios de agua, e incorporar otros genes para la identificación de las especies no pneumophila por la técnica molecular.

Los aspectos previamente considerados —concentración de Legionella en los sistemas domiciliarios y presencia de especies no peumophila— no deben ser desatendidos ante el incremento de casos de legionelosis reportados en la bibliografía, que se producen en la comunidad, están asociados a los sistemas de agua fría y caliente, y son causados por especies diferentes a L. pneumophila. Además de esta última, también fueron implicadas las especies L. anisa, L. dumoffii, L. micdalei, L. bozemani y L. longbeachae, entre otras, como agentes etiológicos de enfermedad humana y recuperadas de sistemas de agua⁵,⁷,²⁰,²⁵.

El cultivo es la técnica de referencia para la identificación de Legionella, permite detectar cualquier especie y realizar estudios posteriores. No obstante, posee una serie de limitaciones dadas por la naturaleza fastidiosa de este microorganismo (que requiere períodos prolongados de incubación), la presencia de biota acompañante (que dificulta su aislamiento) y la secuencia de preparación de la muestra ambiental (que puede disminuir su concentración inicial). Tampoco permite la detección de VNC, que según la bibliografía mantienen su capacidad infectiva³,¹³,²³.

El desarrollo de métodos más rápidos y sensibles, como las técnicas moleculares, permite la detección de Legionella a muy bajas concentraciones, la de material genético proveniente de células muertas, viables no cultivables, o de Legionella presentes en amebas, por lo que un resultado positivo por esta técnica debe ser interpretado críticamente. Una de las limitaciones más importantes es la presencia de inhibidores en la muestra ambiental, que pueden llevar a un resultado falso negativo¹²,³⁶,³⁷.

La combinación del cultivo con técnicas moleculares optimiza la detección e identificación de cepas viables de este patógeno en las muestras de agua⁷,¹²,²⁷,³⁸. Así, a través de la secuencia metodológica adoptada para el presente trabajo, cultivo y posterior qPCR, se confirmó la presencia de L. pneumophila en el 100% de las muestras positivas por cultivo y también la presencia de otras especies no pneumophila en tres de ellas. La combinación de ambas metodologías podría instrumentarse de manera sistemática para una vigilancia más eficaz de esta bacteria en muestras de agua y como alternativa de métodos confirmatorios como los serológicos. Sin embargo, según el objetivo de la investigación, al momento de evaluar una fuente ambiental no se debe desconocer el riesgo potencial de presencia de VNC, que requiere adoptar otra metodología validada³,¹⁹,³⁴.

Legionella se detectó en todas las estaciones del año en los depósitos domiciliarios, pero con mayores recuentos en los meses de verano, en coincidencia con otras publicaciones⁴,³⁹. Sin embargo, al evaluar agua procedente de diferentes reservorios puede haber —además de los climáticos— otros factores responsables en la diferencia de recuentos. La temperatura promedio anual de 21°C del clima subtropical de la ciudad de Resistencia y la legislación vigente, que establece que en el agua de los reservorios domiciliarios no es obligatoria la presencia de cloro activo, agente desinfectante utilizado en el proceso de potabilización, podrían explicaren parte los hallazgos de este trabajo. Estos resultados y el de los autores citados sugieren que la detección de Legionella en agua puede estar influenciada por la fuente analizada, la metodología empleada, el área geográfica y la diversidad ecológica que se da en diferentes partes del mundo¹⁰,⁴⁰. La extensión geográfica y la diversidad climática de Argentina exponen la necesidad de realizar estudios de muestras ambientales en diferentes regiones, que permitan esclarecer la distribución y frecuencia de este patógeno en el país.