INTRODUCCIÓN

Las bacterias de los géneros Ehrlichia, Anaplasma y Rickettsia son organismos coco-bacilares gramnegativos intracelulares obligados pertenecientes al orden Rickettsiales. Algunas de estas especies son transmitidas por garrapatas, que provocan enfermedades emergentes en el territorio argentino.

Rhipicephalus sanguineus s.l son garrapatas con una amplia distribución en Argentina¹-³. Son monotrópicas, es decir, se alimentan preferentemente de una única especie de hospedador, en este caso de los caninos⁴, aunque ocasionalmente muerden a las personas⁵. Con frecuencia se encuentran en caniles o refugios donde las instalaciones ofrecen reparo y hay abundancia de perros⁶. Este complejo de garrapatas ha sido involucrado en la transmisión de numerosos patógenos a los caninos, algunos de ellos de interés zoonótico⁷.

Entre las bacterias que se han detectado en R. sanguineus s.l. se encuentra Rickettsia massiliae, perteneciente al grupo de las fiebres manchadas. Esta bacteria fue aislada por primera vez en Francia en 1992⁸ y desde entonces ha sido vinculada a casos humanos de fiebre manchada en algunos países de Europa. En 2005 se reportó el único caso americano en una paciente originaria de la Ciudad Autónoma de Buenos Aires (CABA)⁹. En Argentina, los valores de prevalencia de R. massiliae en R. sanguineus s.l varían entre 5 y 20%, y su presencia ha sido identificada en garrapatas de CABA¹⁰,¹¹, Bahía Blanca¹² y Mendoza¹³.

Otras bacterias transmitidas por R. sanguineus s.l. son Ehrlichia canis y Anaplasma platys, pertenecientes a la familia Anaplasmataceae¹⁴. Ehrlichia canis es un patógeno que afecta principalmente los monocitos de cánidos y presenta distribución mundial⁷,¹⁵. En Argentina ha sido descripta en perros de CABA y sus alrededores¹⁶,¹⁷, así como en garrapatas Rh. sanguineus s.l de Formosa¹⁸. Por otro lado, Anaplasma platys, descripta por primera vez en perros de Florida, Estados Unidos¹⁹, es el agente causal de la trombocitopenia cíclica canina. Dentro del territorio argentino, ha sido descripta tanto en perros de Bahía Blanca y CABA como en garrapatas de Salta¹², ¹⁶,¹⁸,²⁰. Si bien la signología que produce este patógeno es de leve a moderada en los caninos, puede ser severa si hay coinfección con otros patógenos transmitidos por garrapatas⁷.

El rol de A. platys y E. canis como patógenos en la población humana sigue siendo poco claro. Se han reportado casos clínicos aislados por E. canis en pacientes de Venezuela y Panamá²¹,²². Los pacientes presentaron un síndrome febril agudo con dolores musculares, cefaleas, exantema y signos gastrointestinales. Anaplasma platys ha sido descripto como patógeno para humanos en el Caribe, Venezuela y Colombia como responsable de un cuadro febril agudo caracterizado por trombocitopenia²³,²⁴. Sin embargo, se requiere mayor cantidad de estudios para evaluar el rol zoonótico de estos patógenos.

El partido bonaerense de Pergamino es una de las áreas agroindustriales más importantes de Argentina. No existe ningún antecedente en la región de estudios sobre la presencia de garrapatas en perros, ni sobre la detección de patógenos zoonóticos o de importancia veterinaria transmitidos por estos vectores. El objetivo de este trabajo fue estudiar la presencia de bacterias de los géneros Ehrlichia, Rickettsia y Anaplasma en garrapatas R. sanguineus s.l. extraídas de perros domésticos de la ciudad de Pergamino.

MÉTODOS

La localidad seleccionada para llevar a cabo este estudio fue la ciudad de Pergamino (33°53'01''S , 60°34'01''O). Forma parte de la ecorregión que describe un ambiente definido como Pampa Argentina y, junto con las ciudades de Rosario y Venado Tuerto, integra el triángulo agrario más importante del país, a la vez que concentra un complejo semillero y agroindustrial.

Con el objetivo de obtener ejemplares de garrapatas, este estudio fue llevado a cabo en dos momentos, del 12 al 14 de diciembre de 2016 y del 21 al 26 de febrero de 2017. Los muestreos fueron realizados en los meses cálidos debido a que en ese período se registra una mayor prevalencia y abundancia de garrapatas⁴,²⁵,²⁶.

Para obtener ejemplares de las distintas áreas de la ciudad y no sesgar el muestreo a un único ambiente, Pergamino fue dividida en tres paisajes (urbano, periurbano y rural) según el catastro. En cada uno de los paisajes, se seleccionaron caninos clínicamente sanos con propietario o que pertenecieran a los caniles municipales.

La inspección de cada animal se hizo bajo el consentimiento del propietario y de acuerdo con el siguiente patrón: cabeza, conducto auditivo, cuello, pecho, lomo, abdomen, región perineal, miembros anteriores, miembros posteriores y espacios interdigitales. Las garrapatas se recogieron con una pinza de mano izquierda. En los casos necesarios, se realizó la topicación del artrópodo con fipronil en spray para hacer más sencilla su remoción.

Los ejemplares de garrapatas se colocaron en frascos estériles rotulados, que contenían etanol al 70% para su posterior identificación en el laboratorio. Se utilizaron las claves taxonómicas disponibles²⁷.

Para la extracción de ADN las garrapatas fueron procesadas de forma individual; inicialmente fueron pulverizadas en mortero utilizando nitrógeno líquido y luego se continuó con el método de fenol-cloroformo²⁸.

La identificación de las bacterias del orden Rickettsiales se llevó adelante aplicando diferentes protocolos de PCR. Para la detección de organismos del género Rickettsia se amplificó un fragmento del gen gltA específico del género Rickettsia²⁹. Este gen es de elección, ya que codifica la enzima citrato sintetasa presente en todas las Rickettsias³⁰-³². En cambio, la familia Anaplasmataceae fue identificada amplificando un fragmento del gen 16S rRNA común al género Ehrlichia y Anaplasma³². Las muestras positivas a esta reacción fueron luego analizadas mediante oligonu-cleótidos específicos para el gen ORF30 de Ehrlichia canis³³.

Como control positivo se utilizó ADN de cepas de referencia (Anaplasma marginale y Rickettsia conorii) y como control negativo, agua ultrapura. El proceso de amplificación por PCR se llevó a cabo en un termociclador Bio-Rad MyCycler Thermal Cycler.

Los productos obtenidos a partir de las reacciones de PCR fueron visualizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 1%. Se sembraron 5 pl del producto obtenido y se utilizó el marcador de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Los geles fueron observados en un transiluminador con luz ultravioleta (Gel Doc XP BIO-RAD). Para las reacciones positivas, el producto de PCR fue purificado mediante precipitación y centrifugado con EDTA 125 mM (11,25 pl) y etanol absoluto (200 pl). El precipitado fue lavado con etanol 70% (120 pl) para finalmente ser resuspendido en agua libre de nucleasas. Los productos de PCR fueron enviados a secuenciar al Servicio de Secuenciación del Instituto de Biotecnología de Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Caste-lar, Provincia de Buenos Aires. A partir de las secuencias nucleotídicas obtenidas en archivos con formato ab1 se utilizó el programa Vector NTI Advanced 10 (Invitrogen) como herramienta bioinformática para el ensamblado de secuencias y el armado de los contings.

Las secuencias obtenidas para el fragmento del gen 16S rRNA común al género Ehrlichia y Anaplasma fueron utilizadas para construir un árbol filogenético a fin de definir la especie implicada en aquellos casos en los que la amplificación del gen ORF30 de Ehrlichia canis resultó negativa.

Las maniobras de remoción de garrapatas sobre los animales se cumplieron bajo las normas de buenas prácticas y bienestar animal del capítulo 7 del Código Sanitario para los Animales Terrestres de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE, por sus siglas en inglés).

RESULTADOS

Se revisaron en total 52 caninos provenientes de diferentes ambientes de la ciudad de Pergamino. El 60% de esos perros eran hembras. Hubo un 80% de raza indefinida (mestizos), 5% de galgos, 3% de caniches y 12% de otras razas (ovejero alemán, Schnauzer, maltés, Shih Tzu, braco alemán).

Se colectaron 21 garrapatas (18 ejemplares durante el primer muestreo). Del total de los perros revisados, el 13,4% (7/52) presentaron, al menos, una garrapata. El 100% de los ejemplares colectados e identificados pertenecían al complejo Rhipicephalus sanguineus. Todos eran adultos, con 58% de hembras (12/21) y 42% de machos (9/21). Dos ejemplares (2/21) eran hembras en estadio de teleogina (estadio previo a descender al suelo para la ovoposición con completa repleción corporal por la ingesta de sangre). No se encontraron otros ectoparásitos en los perros revisados durante estos dos muestreos específicos.

En lo que respecta al género Rickettsia, la amplificación del gen gltA de Rickettsia spp. resultó positiva en un solo ejemplar de R. sanguineus s.l (1/21) (ver Figura 1). El alineamiento global de la secuencia obtenida mostró una identidad del 100% con la secuencia de referencia de Rickettsia masslllae AZT80 depositada en GenBank (CP003319.1).

En la familia Anaplasmataceae, se detectó positividad para el gen 16SrRNA común a los géneros Ehrlichia/ Anaplasma en el 42,8% (9/21) de las muestras, de las cuales 5 (23,8% del total) resultaron además positivas a la reacción específica para E. canis. Para definir la especie correspondiente a las 4 muestras restantes (4/21) positivas al gen J6SrRNA de Ehrlichia/Anaplasma, se construyó un árbol filogenético utilizando el método de Maximum Likelihood con 1000 réplicas de bootstrap en el programa MEGA 6.06. Se usaron secuencias de referencia de la familia Anaplasmataceae y una secuencia de Rickettsia rickettsii como outgroup (ver Figura 2). Como resultado se observó la presencia de un clúster conformado por las cuatro secuencias obtenidas de las muestras de garrapata y la secuencia de referencia de A. platys (AF536828.1).

FIGURA 2 Árbol filogenético basado en el algoritmo de Maximum Likelihood con 1000 réplicas de bootstrap. Clúster conformado por las 4 secuencias obtenidas de las garrapatas y la cepa de referencia Anaplasma platys. 

DISCUSIÓN

Este estudio representa el primer reporte de garrapatas positivas a R. massiliae, E. canis y A. platys para el norte de la provincia de Buenos Aires, y permite ampliar la distribución geográfica conocida de los tres patógenos. Particularmente, la importancia sanitaria de R. massiliae radica en que es el agente etiológico de una fiebre manchada caracterizada en el humano por fiebre, cefaleas, exantema maculo-purpúrico, disminución aguda bilateral de la visión por coriorretinitis y una escara de inoculación en el sitio de mordedura de la garrapata³⁴-³⁷. Hasta la fecha, no se ha reportado letalidad en los casos confirmados.

En este estudio, la tasa de positividad en garrapatas R. sanguineus s.l de la ciudad de Pergamino fue del 4,7%. En perros, R. massiliae puede generar un cuadro clínico caracterizado por signos inespecíficos (decaimiento, fiebre, mialgias), edema en zonas ventrales y signos neurológi-cos³⁸. En el momento de la revisación y de la extracción de las garrapatas, ninguno de los perros presentó signos clínicos compatibles con este agente.

En el presente estudio E canis se detectó con un nivel de positividad del 23,8% en las garrapatas R. sanguineus s.l, y al momento de la toma de muestra los perros no presentaron signos de decaimiento, ni mucosas pálidas, ni fiebre. Otro de los patógenos identificados, en el 19,04% de las garrapatas estudiadas, fue Anaplasma platys. La anaplasmosis en los caninos puede ser asintomática o subclínica⁷. Como se expresó anteriormente para el resto de los patógenos identificados, al momento de la exploración clínica y la obtención de muestras los animales no presentaron signología compatible con anaplasmosis.

La presencia de los patógenos mencionados, ya sea en las garrapatas o en la ingesta de sangre, indica circulación local entre los perros y sus respectivos vectores. Asimismo, la presencia de patógenos en R. sanguineus s.l implica un riesgo sanitario directo para la población humana. Esta importancia sanitaria radica en que Rh. sanguineus s.l parasita ocasionalmente a los seres humanos⁵, tal como ha sido registrado en diferentes partes del mundo^39-41 con distintas frecuencias. En Europa mediterránea³⁵, Rh. sanguineus s.l parasita a las personas con mayor frecuencia que en Suda-mérica⁴²,⁴, o quizás aquí este evento sea menos reportado. En el caso particular de Argentina, existen registros de mordedura de Rh. sanguineus s.l a la población humana en las provincias de Salta, Santa Fe⁴² y Misiones⁴³; en lo que respecta a la provincia de Buenos Aires, los reportes corresponden a la Ciudad Autónoma de Buenos Aires y a la ciudad de Bahía Blanca⁴⁴ . Uno de los factores que determinan la agresividad de Rh. sanguineus s.l frente a los humanos son las fuertes temperaturas³⁵. El aumento prolongado de temperaturas o los veranos extensos podrían incrementar el riesgo de mordedura de esta garrapata a la población humana. Asimismo, las personas en contacto estrecho con perros (veterinarios, empleados de tiendas de mascotas, propietarios etc.) tendrían un mayor riesgo⁴⁵. Cabe destacar que los perros muestreados en este estudio no recibían en forma regular un tratamiento acaricida específico. Por lo tanto, es fundamental el control veterinario periódico y la tenencia responsable como medida de mitigación de riesgo, tanto para la población animal como humana. La presencia de bacterias patógenas en garrapatas de la ciudad de Pergamino plantea un potencial escenario de transmisión a la población humana, donde el grupo de riesgo está constituido por aquellas personas que trabajan o conviven con perros sin controles sanitarios.

RELEVANCIA PARA POLÍTICAS E INTERVENCIONES SANITARIAS

Es fundamental sensibilizar al sistema de salud local con respecto a las rickettsiosis, en especial la producida por R. massiliae, que ha sido reportada en el ámbito urbano y periurbano en diferentes partes del mundo (incluida Argentina). Sería importante elaborar un algoritmo diagnóstico de esta rickettsiosis y establecer criterios claros para definir el caso sospechoso, probable y confirmado. Por otro lado, hay que continuar desarrollando investigaciones a fin de comprender el rol de E. canis y A. platys como agentes zoonóticos y su impacto en la salud veterinaria a nivel local. Es primordial que los agentes de salud consideren, dentro de sus diagnósticos diferenciales, las enfermedades transmitidas por garrapatas.

RELEVANCIA PARA LA FORMACIÓN DE RECURSOS HUMANOS EN SALUD

Este estudio constituye el primer antecedente de patógenos transmitidos por garrapatas para el norte de la provincia de Buenos Aires y acrecienta los registros de circulación de bacterias de los géneros Ehrlichia, Anaplasma y Rickettsia en Argentina. En este trabajo participaron veterinarios, biólogos y bioquímicos, lo que permite abarcar una mirada global e integral de una problemática compleja como la de las enfermedades transmitidas por vectores.

RELEVANCIA PARA LA INVESTIGACIÓN EN SALUD

Estos hallazgos contribuyen a conocer mejor la epidemiología de patógenos transmitidos por garrapatas que afectan la salud humana y animal en zonas urbanas/ periurbanas y a concientizar de tal modo a la población acerca de las medidas necesarias de prevención. Es fundamental continuar con estudios regionales para establecer los diferentes eslabones, su interacción y comprender la eco-epidemiología de las enfermedades transmitidas por garrapatas en Argentina.