PRUEBAS PARA LA DETECCIÓN DEL SARS-CoV-2

Las NAAT que se utilizan para la confirmación y vigilancia de la propagación del SARS-CoV-2 fueron desarrolladas principalmente por investigadores de Alemania, China, Estados unidos de América y Japón^5-8.

En la práctica clínica, sobre todo en la fase aguda de la infección, las rRT-PCR (transcripción inversa del ARN seguida de PCR en tiempo real) se consideran el "patrón oro" para la detección del genoma del SARS-CoV-2, pero su utilización en casos en los que no hay exposición viral confirmada es aún controvertida. De hecho, las pruebas de rRT-PCR actuales se validaron con paneles de material en una situación idealizada y con muestras de pacientes que contenían cargas virales a niveles diferentes de los encontrados en tamizados poblacionales⁹, ¹⁰.

AMPLIFICACIÓN ISOTÉRMICA MEDIADA LAMP

La amplificación de isotérmica de ácidos nucleicos (LAMP, por su sigla en inglés) es una reacción que permite amplificar secuencias de ácidos nucleicos con cuatro a seis cebadores en condiciones isotérmicas (63 °C-65 °C) y produce resultados que pueden determinarse de forma visual. Para varios virus respiratorios, esta técnica ha demostrado límites de detección similares a los de la rRT-PCR (1.000 copias/ml)¹¹, ¹².

RIESGOS DE RESULTADOS FALSOS DURANTE LOS PROCEDIMIENTOS PREANALÍTICOS

A pesar de las mejoras continuas en la automatización, es frecuente ver resultados falsos en la fase preanalítica¹³.

La detección de virus se ve afectada por el momento de la toma de la muestra (antes o después de la aparición de los síntomas), la calidad de los procedimientos de toma de muestras (hisopos nasofaríngeos y orofaríngeos) y las soluciones para el transporte y la conservación viral¹⁴.

Después de la toma de muestras, los tubos que contienen virus ARN requieren un cuidado especial, debido a la degradación del ARN. La inactivación de la infecciosidad que se realiza en varios laboratorios a 56°C altera la integridad del ARN viral y afecta la calidad de los resultados, sobre todo en muestras con carga viral baja¹⁵.

La Organización Mundial de la Salud y las autoridades sanitarias locales recomiendan que todos los procedimientos operativos garanticen que el personal esté capacitado y subrayan el riesgo potencial de infección. Para ello, las normas de bioseguridad establecen el dis-tanciamiento físico, con equipo de protección adecuado para cada uno de los trabajadores de la salud. Se debe disponer de máscaras, protectores oculares, delantales, gorras, guantes y los elementos necesarios en entornos clínicos y en laboratorios. Sin embargo, las barreras mecánicas no protegen las muestras de la contaminación cruzada (por ejemplo, del ARN viral que puede adherirse a los guantes). Los hisopos con secreciones mucosas, células potencialmente infectadas y partículas virales libres se deben introducir en tubos y cerrarlos con firmeza (en general, esto sucede con guantes contaminados con mi-crogotas virales). Numerosos centros de muestreo desinfectan los guantes, pero las sustancias utilizadas a tal fin no eliminan ácidos nucleicos adheridos.

Se obtuvieron pruebas de PCR positivas con el enjuague de guantes utilizados durante campañas de detección de infecciones oculares¹⁶, por lo que es preciso subrayar el riesgo de resultados falsos positivos si se desprenden genomas virales en una etapa posterior.

El cambio de guantes después de la toma de muestras de cada persona es poco factible con presupuestos sanitarios restringidos, y el costo de productos que destruyen ácidos nucleicos es muy alto. Una opción es disponer de una solución estándar de ácido clorhídrico (ácido clorhídrico 1 normal, útil para destruir ácidos nucleicos) preparada a diario. Se impregnan trozos de gasa estéril con la solución y se las pasa en superficies potencialmente contaminadas después de desinfectarlas con agentes biocidas. Este procedimiento es viable desde el punto de vista de los costos, aunque puede complicar la rutina del sector.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA LA RRT-PCR

Se debe evitar que los genomas de los coronavirus (ARN de una sola cadena) se expongan a las ARNasas, enzimas abundantes en el medio ambiente y en las manos que degradan las moléculas de ARN. Por este motivo, los procedimientos de aislamiento y purificación de los ARN requieren técnicas asépticas con soluciones y materiales libres de ARNasas.

La preparación de la muestra tiene por objeto extraer los ácidos nucleicos para hacerlos accesibles a la retrotranscripción y a la amplificación, con la eliminación de posibles inhibidores de esas reacciones.

Al inicio de la preparación en el laboratorio, se abren las tapas de los tubos para retirar los hisopos del medio de transporte, y se introducen secuencias de ARN en volúmenes especificados, que servirán como control interno (CI). Esas secuencias no deben estar relacionadas con los coronavirus. Para todas las PCR asociadas a contextos clínicos, los CI se extraerán, retrotranscribirán y amplificarán de manera simultánea y en el mismo tubo con la muestra para validar que todos los procedimientos y reacciones se han llevado a cabo de forma correcta¹⁷.

Para la extracción de los ácidos nucleicos virales se pueden utilizar, por ejemplo, microesferas magnéticas recubiertas de silicio (sistemas automáticos o manuales), que permiten extraer el elemento a amplificar en presencia de concentraciones de proteínas y lípidos, entre otros compuestos. Las partículas de silicio activado tienen la capacidad de capturar ácidos nucleicos que, una vez lavadas para eliminar el material no fijado, disocian los ácidos nucleicos con soluciones especiales que se transfieren a una placa para proseguir con las reacciones de amplificación. La extracción manual de ARN es menos eficiente que la que se realiza con sistemas automáticos robotizados¹⁸.

TRANSCRIPCIÓN INVERSA

La PCR amplifica ácido desoxirribonucleico (ADN), por lo que los ARN extraídos y purificados deben transformarse en ADN complementario (ADNc) gracias a la acción de la transcriptasa inversa dotada de actividad de la enzima rTth, derivada de la bacteria Thermus thermophilus. La enzima rTth es una ADN polimerasa termoestable que puede a su vez ejercer la actividad de transcriptasa inversa.

Para este proceso se mezclan los ácidos nucleicos purificados con cebadores inversos del SARS-CoV-2 y del control interno (CI), que se fijan en sus respectivos blancos moleculares y se extienden. La doble cadena neoformada se abre por acción del calor y más cebadores se fijan en los ADNc (del CI y del blanco molecular) y se extienden. Los procedimientos de extracción y transcripción inversa requieren de pipeteados en serie de soluciones que se introducen en los tubos de reacción. Estos procedimientos acarrean riesgos de contaminación cruzada por salpicado de microgotas imperceptibles.

LA NECESIDAD DE CONTROLES ENDÓGENOS

Las células epiteliales que recubren las fosas nasales y el epitelio respiratorio orofaríngeo expresan los receptores del SARS-CoV-2, y deben estar presentes en las muestras que se vayan a analizar.

Con muestras obtenidas por raspados de la conjuntiva de niños con signos clínicos de tracoma activo, se determinó que las muestras que contenían menos de 50 células/pl del líquido de transporte del hisopo arrojaban resultados negativos falsos. Esta situación se reprodujo para otros agentes infecciosos de tejidos mucosos o epiteliales¹⁹.

Las rRT-PCR para SARS-CoV-2 utilizan señales producidas por el gen de la R-actina o el gen de la subunidad p30 de la ribonucleasa celular (RPP30). Estos marcadores no fueron calibrados con células epiteliales diluidas en serie para determinar en cada muestra la carga celular de forma directa. Sin embargo, la mera apreciación cualitativa mostró una fuerte asociación entre los resultados positivos de la rRT-PCR para el SARS-CoV-2 y los niveles elevados de RPP30²⁰.

Por otra parte, cuantificar el número de células en una muestra permite uniformizar un denominador para la carga viral (copias de ARN viral/número de células presentes en una muestra). Se identificaron resultados falsos negativos de manera fiable en muestras con expresión baja del gen RPP30, así como en la mayoría de los resultados contradictorios de rRT-PCR²¹. Por ende, la negatividad para el SARS-CoV-2 no puede validarse en muestras que contienen cargas celulares (determinadas con controles endógenos) inferiores al umbral a determinar.

AMPLIFICACIÓN DE GENES

El genoma del SARS-CoV-2 se estructura con una cadena de ARN positivo. El extremo terminal 3' del genoma codifica cuatro proteínas estructurales: la glicoproteína de la espícula (S), la proteína de envoltura (E), la glicoproteína de membrana (M) y la fosfoproteína de la nucleocápside (N) con proteínas accesorias. Las sondas utilizadas para la detección de las secuencias amplificadas se diseñan y sintetizan con oligonucleótidos de ADN de una sola cadena marcados con fluoróforos en el extremo 5' y bloqueadores de la fluorescencia (quenchers) en el extremo 3'. Cada sonda viene marcada con un fluoróforo diferente para detectar los diferentes productos amplificados en el mismo microtubo de manera simultánea. En ausencia de la diana molecular reconocida por la sonda, la fluorescencia permanece apagada, pero si es reconocida, las secuencias complementarias se hibridan, y el fluoróforo se separa del componente que oculta su señal. A medida que se copian cadenas nuevas de ADN, el programa de la computadora rastrea la fluorescencia producida. La rRT-PCR (transcripción inversa del ARN seguida de la reacción de amplificación encadena) requiere de 40 ciclos de amplificación del blanco molecular buscado (2 elevado a la potencia 40). Las señales que superan un umbral (región de amplificación exponencial) definen el ciclo de umbral o Ct²².

Los kits de rRT-PCR comercializados en la actualidad no mostraron reacciones cruzadas con el panel de otros virus respiratorios, excepto para el gen E del SARS-CoV-1¹⁶, ²³. Por eso, la detección de una sola señal no es suficiente para considerar positiva la rRT-PCR. Se consideran positivas las muestras que detectan un mínimo de dos o tres señales del genoma del virus: S, M, E y N. Los resultados discordantes en pacientes sintomáticos requieren el procesamiento de una muestra nueva.

RESULTADOS NEGATIVOS Y FALSOS NEGATIVOS

Las señales producidas en cada muestra por el CI deben ser las mismas que las obtenidas con los controles negativos y blancos. Los retrasos de las señales de los CI en una muestra revelan deficiencias en la extracción o en la retrotranscripción, o la presencia de Inhibidores de alguna de las etapas de la rRT-PCR. En estas circunstancias, un resultado negativo no se puede informar y se requiere una nueva muestra.

Para este tipo de técnicas de laboratorio se pipetean volúmenes extremadamente reducidos (5 o 10 pl), por lo que se requieren precauciones para evitar el ingreso de mi-croburbujas de aire a las puntas de las pipetas (difíciles de detectar por el ojo humano) ya que poco material disponible para la amplificación puede originar falsas conclusiones.

Se han descripto rRT-PCR positivas para casos asintomáticos en niveles del 30,8% en Japón²², del 50% en el crucero Diamond Princess y del 56,5% en los Estados Unidos²³, ²⁴.

Siete estudios presentaron resultados de la rRT-PCR desde el inicio de aparición de los síntomas o de posibles contactos desde el día desde que se estimó la infección con SARS-CoV-2 (personas expuestas y trabajadores de la salud). Estos estudios demostraron que durante los cuatro primeros días de la infección y antes del momento de aparición de los síntomas (día 5), la probabilidad de un resultado falso negativo en una persona infectada es alta. En el día de la aparición de los síntomas, la tasa media de falsos negativos fue del 38% y disminuyó al 20% (12%-30%) el día 8 (tres días después de la aparición de los síntomas) y luego comenzó a aumentar de nuevo, de 21% (13%-31 %) el día 9 hasta el 66% (54%-77%) el día 21. De lo anterior se deduce que las rRT-PCR añadieron poca información diagnóstica en los días inmediatamente posteriores a la exposición al virus. Para reducir las conclusiones erróneas se sugirió entonces tomar muestras uno a tres días después de la aparición de los síntomas. Sin embargo, en caso de sospecha clínica elevada y en contextos de transmisión viral, no debe descartarse la presencia del virus únicamente sobre la base de resultados negativos de la rRT-PCR²⁵.

Por otra parte, informes procedentes de China mostraron resultados falsos negativos durante un período de hasta dos semanas post exposición. En análisis realizados sobre muestras repetidas se informaron resultados falsos negativos entre el 2% y el 33% de las muestras analizadas²⁶.

Con base en lo antedicho, en los primeros días de la infección viral por SARS-CoV-2 o de cualquier otro virus respiratorio, los resultados negativos de las pruebas de rRT-PCR deberían ser considerados marcadores necesarios, pero no suficientes, para eliminar las precauciones destinadas a evitar la transmisión de la infección. En caso de duda, la tomografía computarizada (TC) torácica ofrece imágenes patognomónicas que ayudan en ciertas circunstancias, a aclarar el diagnóstico (sin embargo, se informaron TC torácicas normales en personas con rRT-PCR positivas)²⁷.

RESULTADOS POSITIVOS Y FALSOS POSITIVOS

Los resultados positivos de la rRT-PCR revelan la presencia de ARN viral, pero no predicen la virulencia ni la transmi-sibilidad, ni tampoco descartan infecciones bacterianas o coinfecciones con otros virus. Esta confusión pudo haber llevado a considerar la existencia de "numerosísimos casos infectados" cuando en realidad se trataba del número de pruebas con resultados positivos.

En la ciudad de Nueva York, los estudios en los que la rRT-PCR para detectar la presencia del genoma viral fue seguida por la detección de anticuerpos anti-SARS-Co-V2, demostraron que de los 624 participantes con síntomas de COVID-19 confirmados, todos menos tres produjeron anticuerpos específicos contra la proteína de la espícula del SARS-CoV-2, mientras que la seroconversión pudo verificarse solo en el 37% de personas rRT-PCR positivos con sospecha de infección. Estos resultados sugieren que en esos casos, las conclusiones referidas a la presencia del virus fueron erróneas²⁸.

Las rRT-PCR realizadas en trabajadores expuestos del área de la salud de la región del Véneto (Italia) también detectaron anticuerpos específicos en el 100% de los casos clínicos graves de COVID-19 pero solo en el 83% de los que presentaban síntomas moderados. Los sujetos asintomáticos con rRT-PCR positiva mostraron una tasa de seroconversión significativamente menor (58%)²⁹.

Las rRT-PCR positivas realizadas con muestras de personas en estrecho contacto con pacientes con COVID-19 en Jiangsu (China) se correlacionaron con imágenes torácicas patognomónicas en el 50% de los sujetos asintomáticos, y ninguno de los pacientes asintomáticos desarrolló neumonía grave o murió. Por otra parte, en los sujetos asintomáticos con rRT-PCR positiva, los resultados de laboratorio fueron normales en 55% de los casos y la disminución de los linfocitos circulantes (uno de los marcadores de infección viral) se observó solo en el 16%. Los niveles de la proteína C reactiva (marcador biológico de inflamación) estaban ligeramente por encima del rango normal y solo en el 14% de los casos. Los resultados de estos estudios sugieren que un número importante de rRT-PCR positivas en personas asintomáticas no fueron indicadoras de la infección por el SARS-CoV-2. Sobre este punto, cabe destacar que, desde el inicio de 2020, el Centro de Control y Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos y otros entes sanitarios internacionales retiraron del comercio varios kits por la tasa elevada de resultados falsos³⁰ sin haber adicionado aun los riesgos del muestreo ni del procesamiento de las muestras.

De lo mencionado se infiere que, para los individuos asintomáticos en los que no se detecten anticuerpos dirigidos contra el SARS-CoV-2, la interpretación de los resultados positivos de las pruebas de rRT-PCR requiere extrema cautela.