Introducción

El géneroSchizachyriumNees (Poaceae, Andropogoneae) comprende cerca de 60 especies, distribuidas en regiones tropicales y subtropicales del mundo, la mayoría de ellas concentrada en América y África (^{Türpe, 1984}; ^{Clayton et Renvoize, 1986}; ^{Nicora et Rúgolo de Agrasar, 1987}; ^{Peichoto, 2010}; ^{Soreng et al., 2017}). Existen varios centros de diversificación del género, habiéndose reportado especies nativas y endémicas para América, África, Asia y Australia (^{Watson et Dallwitz, 1992}; Clayton et al., 2006; ^{Shouliang et Phillips, 2006}). Para América se han citado 30 especies que se distribuyen desde Canadá hasta Chile, Argentina y Uruguay (^{Filgueiras, 2003}). En Sudamérica, en particular, la mayor concentración de especies se encuentra en las praderas naturales de Brasil, Paraguay, Uruguay y Argentina (Peichoto, 2010), siendo las sabanas y pastizales del nordeste de Argentina (NEA), uno de los principales centros de diversificación del género en Sudamérica (Peichoto et al., 2015). En la región NEA habitan 13 especies (cinco de ellas propias de la zona), de las cuales doce crecen en la provincia de Corrientes (Peichoto et Keller, 2008; Peichoto, 2010, 2012); siendoS. bimucronatumRoseng., B.R. Arrill. & Izag. una especie endémica de Argentina (Flora Argentina, 2021).

Desde el punto de vista citogenético, la mayoría de las especies son diploides (^{Gould, 1956}; ^{Killeen, 1990}),Schizachyrium salzmannii(Trin. ex Steud.) Nash, S. sanguineum(Retz.) Alston, S. scabriflorum(Hack.) A. Camus yS. tenerumNees presentan diferentes niveles de ploidía, siendoS. sanguineumel único complejo poliploide (^{Carman et Hatch, 1982}; ^{Norrmann et al., 1994}; ^{Peichoto et al., 2011}). Asimismo, en un estudio filogenómico en Andropogoneae, se reportaron eventos de alopoliploidía enS. sanguineumy se sugirió la diferenciación de especies crípticas, así como la ocurrencia de eventos de hibridación e introgresión en esta especie (^{Arthan et al., 2017}).

Las especies deSchizachyriumson plantas cespitosas, anuales o perennes, que presentan un importante rango de variación en el grado de ramificación de sus vástagos floríferos (^{Clayton et Renvoize, 1986}). Durante la revisión de las especies sudamericanas deSchizachyriumse definieron dos grupos morfológicos basados en rasgos de la inflorescencia: un grupo incluye las especies con inflorescencias escasamente ramificadas con entrenudos del raquis y pedicelos gruesos y rectos; mientras el otro grupo comprende taxones con inflorescencias muy ramificadas con entrenudos del raquis y pedicelos delgados y flexuosos a la madurez (^{Peichoto et al., 2008}; Peichoto, 2010). Además, se han observado algunos especímenes con morfología intermedia entre ambos grupos, habiéndose sugerido un posible origen híbrido (Peichoto et al., 2015).

El conocimiento de la variabilidad, diferenciación y estructura genética de las especies puede contribuir a la resolución de la circunscripción de las especies, así como a evaluar el potencial papel evolutivo de la hibridación natural (McCauley, 1995; ^{Ouborg et al., 1999}; ^{Avise, 2004}). Sin embargo, hasta el momento, las especies sudamericanas deSchizachyriumno han sido estudiadas desde un punto de vista genético-poblacional.

En este contexto, a fin de evaluar la utilidad de los estudios genético-poblacionales en la identificación de las especies, así como el papel de la hibridación natural en la evolución de las especies deSchizachyrium,en el presente trabajo se analiza la variabilidad, diferenciación y estructura genética de poblaciones naturales deS. bimucronatum,S. sanguineumyS. tenerum,que son frecuentes componentes de campos abiertos y sabanas circundantes de bosques en la provincia de Corrientes, Argentina (^{Peichoto, 2007}), utilizando marcadores nucleares y de cloroplasto.

Materiales y Métodos

Un total de 59 individuos deSchizachyrium bimucronatum,S. sanguineumyS. tenerumfueron muestreados durante 2014-2015 en seis poblaciones naturales de la provincia de Corrientes, Argentina (Fig. 1, Tabla 1). En cada población se colectaron hojas jóvenes las que fueron deshidratadas en silica-gel. Para cada población se obtuvieron las coordenadas geográficas utilizando una unidad de sistema de posicionamiento global (GPS). Los ejemplares testigo del material estudiado están depositados en el herbario del Instituto de Botánica del Nordeste (CTES).

Resultados

RAPD

De los 19 cebadores probados, fueron seleccionados cuatro (OPO-1, OPO-3, OPO-10 y OPO-12) por presentar mayor polimorfismo y nitidez de bandas. Sobre un total de 115 bandas observadas, OPO-10 fue el cebador con el mayor número de fragmentos amplificados con un total de 41 bandas (Tabla 2).

Todas las especies presentaron bandas exclusivas, variando desde cinco bandas enS. bimucronatuma 18 bandas enS. sanguineum. El porcentaje delocipolimórficos varió entre las poblaciones desde 23,48% enS. bimucronatuma 60,87% enS. sanguineum. Schizachyrium bimucronatumpresentó los valores de diversidad genética más bajos, como así también el menor número de bandas exclusivas con una población en la que se observó una sola banda exclusiva (P-351) y otra con ninguna (P-354).Schizachyrium sanguineumfue la especie con los mayores valores de diversidad genética y el mayor número de bandas exclusivas, variando entre dos (P-343) a ocho bandas (P-348). EnS. tenerumse observaron valores intermedios de diversidad genética y seis bandas exclusivas (Tabla 1).

El análisis de agrupación Bayesiana mostró que las poblaciones pueden ser representadas en siete grupos (K= 7; Fig. 2). La mayoría de los individuos presentaron altos valores de pertenencia a un solo grupo en particular. En general, los grupos se correspondían con cada especie y/o población analizada, a excepción deS. sanguineum, en la que se detectaron dos poblaciones con una proporción del genoma compartido entre ellas. A su vez, se encontraron individuos con una proporción de su genoma compartida principalmente entre las poblaciones deS. sanguineumyS. bimucronatum.

Los resultados del AMOVA y el Φ_STresultaron significativos (Tabla 3), observándose la mayor variación dentro de las especies. Cuando se consideraron las poblaciones, enS. bimucronatumla mayor variación se observó entre poblaciones, mientras que enS. sanguineumla mayor variación es intrapoblacional. Se excluyó de esta última parte del análisis aS. tenerumpor contar con una sola población.

El PCoA reveló que las 3 primeras coordenadas representan el 40% de la variación total siendo las coordenadas 1 y 2 las que expresan mayor variación (Fig. 3). La coordenada 2 separa a los individuos deS. bimucronatumde los deS. tenerum. En el caso deS. sanguineumlos individuos se presentan más dispersos, aunque no llegan a entremezclarse con los de las otras dos especies.

ADNcp

El alineamiento de la región no codificante de ADNcpmatK5´-matK6 resultó en una secuencia de 544 pb en total. De los 544 pb analizados, 24 fueron polimórficos. En el género como un todo se encontraron diez haplotipos, con una diversidad haplotípica elevada (h= 0,751) y una diversidad nucleotídica baja (π= 0,012). Cada especie presentó entre tres y cuatro haplotipos exclusivos, mientras que ningún haplotipo fue compartido entre especies. Con respecto a los índices de variabilidad por especie, el mayor valor de diversidad haplotípica se observó enS. tenerum(h= 0,51) mientras que el menor valor se observó enS. sanguineum(h= 0,28). En esta última especie se observó el mayor índice de diversidad nucleotídica (π= 0,020), siendo el menor valor el deS. bimucronatum(π= ٠,٠٠٠١).Schizachyrium sanguineumtambién fue la especie en la que se observó el mayor número de haplotipos (cuatro), mientras que en cada una de las otras dos especies se encontraron tres haplotipos (Tabla 1).

Las dos poblaciones deS. bimucronatumcompartieron dos de los tres haplotipos encontrados para la especie, mientras que en la población P-354 se encontró además un haplotipo exclusivo. De las tres poblaciones deS. sanguineumestudiadas, la población P-348 presentó un único haplotipo compartido con las otras dos poblaciones, en las que se observaron tres haplotipos en cada una, cada población con uno exclusivo y los otros dos compartidos. Finalmente, en la única población estudiada deS. tenerumse encontraron tres haplotipos. El porcentaje de variación genética obtenido por el AMOVA mostró que el 91,75% ocurre entre las especies (Φ_ST= 0,92; p= 0,02) (Tabla 4).

La red de haplotipos (Fig. 4) presentó un haplotipo más frecuente o central para cada especie a partir de los que derivan haplotipos menos frecuentes o de punta. Estos últimos separados del haplotipo central del cual derivan por una o pocas mutaciones. Los haplotipos se agruparon claramente en tres haplogrupos (separados por numerosas mutaciones), correspondientes a cada especies analizada, con excepción del haplotipo 2 detectado en una población deS. sanguineum, más relacionado conS. bimucronatum, aunque con un vector mediano de por medio.

Fig. 1. Distribución de las poblaciones deSchizachyriumanalizadas. Fig. 1.Distribution of theSchizachyriumpopulations analyzed. 

Fig. 2 Agrupaciones Bayesianas inferidas por STRUCTURE a partir de los datos de RAPDs deSchizachyrium. Cada individuo está representado por una barra vertical. Las barras están divididas en K= 7 componentes que representan la proporción del genoma de cada individuo asignada a un grupo genético. Las especies y las poblaciones estudiadas se indican por encima y por debajo del gráfico, respectivamente. Fig. 2.Bayesian clusters inferred by STRUCTURE based on RAPDs data ofSchizachyrium. Each individual is represented by a single vertical bar. Bars are partitioned into K= 7 components that represent each individual’s proportional assignment to one of the genetic clusters. The species and the population analyzed are indicated above and below the figure, respectively. 

Fig. 3 Representación gráfica del Análisis de Coordenadas Principales (PCoA) basado en las distancias genéticas de Nei entre los individuos deSchizachyrium, a partir de marcadores RAPD. Fig. 3.Graphic representation of the Principal Coordinate Analysis (PCoA) based on Nei’s genetic distance between individuals ofSchizachyriumobtained with RAPD markers. 

Fig. 4. Red de haplotipos que muestra las relaciones evolutivas entre los diez haplotipos encontrados en las poblaciones deSchizachyriumanalizadas. Cada círculo representa un haplotipo, el tamaño de los mismos es proporcional a su frecuencia. Las líneas que unen a los círculos representan las relaciones entre los haplotipos y las líneas sobre éstas representan las mutaciones que separan un haplotipo de otro. Los vectores medios (mv) se indican con círculos rojos. Fig. 4. Haplotype network showing evolutionary relationships among ten haplotypes found in theSchizachyriumpopulations analyzed. Each circle represents a haplotype; the size of the circles is proportional to their frequency. The lines joining the circles represent the relationships between haplotypes and the lines above them represent the mutations separating one haplotype from another. The mean vectors (mv) are indicated by red circles. 

Discusión

El presente trabajo constituye el primer aporte al conocimiento de la variabilidad, diferenciación y estructura genética deSchizachyrium bimucronatum,S. sanguineumyS. tenerum. Hasta el momento, la única especie estudiada desde el punto de vista genético-poblacional eraS. scoparium(Michx.) Nash var.scopariumde Estados Unidos (^{Carman et Briske,1985}; ^{Huff et al., 1998}; Harris-Schultz et al., 2015). Por lo tanto, los resultados aquí obtenidos constituyen también los primeros análisis genético-poblacionales en especies sudamericanas deSchizachyrium.

El análisis empleando marcadores nucleares mostró que las especies deSchizachyriumanalizadas difieren genéticamente entre sí. Asimismo, el hecho que en el PCoA los individuos de las especies deSchizachyriumestudiadas forman grupos claramente identificables concuerda con la distinción de los grupos morfológicos en las especies sudamericanas del género (^{Peichoto et al., 2008}; Peichoto, 2010). De este modo, los individuos deS. bimucronatumque presentan inflorescencias ramificadas con entrenudos del raquis delgados, se separan de los individuos deS. sanguineumyS. tenerum, que poseen inflorescencias poco ramificadas y entrenudos del raquis gruesos. Estos resultados están sustentados, además, por los valores significativos del índice ɸ_ST, el hallazgo de haplotipos especie-exclusivos de ADN cloroplástico así como la correspondencia de los haplogrupos identificados en la red de haplotipos con cada especie analizada. Todos estos resultados sugieren que los análisis genético-poblacionales basados en marcadores nucleares y de cloroplasto combinados podrían contribuir a la delimitación más precisa de las especies y complementar los tratamientos taxonómicos para la clasificación infragenérica de las especiesSchizachyrium. Nuevos estudios incluyendo un número mayor de poblaciones de las especies estudiadas así como de otras especies permitirán poner a prueba esta hipótesis.

Por otra parte, la estructura genética detectada con marcadores nucleares fue menor que la encontrada con marcadores cloroplásticos, posiblemente como consecuencia de las diferentes tasas en las que actúa la deriva génica en cada marcador (^{Moore, 1995}), de las diferencias en los mecanismos de dispersión de las semillas y el polen (^{Palma-Silva et al., 2009}; ^{Pinheiro et al., 2011}) o de los tiempos de coalescencia de ambos marcadores (^{Cabanne et al., 2008}); así como de la hibridación e introgresión (^{Acosta et Premoli, 2010}). En este sentido, los resultados de los análisis bayesianos basados en marcadores nucleares evidenciaron que, aunque en general los individuos de las poblaciones analizadas conformaron grupos independientes, en cada una de dichas poblaciones se detectaron individuos con una proporción de sus genomas asignable a los genomas de las otras poblaciones o incluso de las otras especies del género, sugiriendo la ocurrencia de eventos de hibridación. La hibridación ha tenido un papel muy importante en la evolución de las plantas. En las Angiospermas, se estima que los eventos de hibridación estuvieron involucrados en el origen del 30-80% de las especies (^{Rieseberg, 1997}; ^{Arnold 1992}; Rieseberg et al., 1993;^{Abbott et al., 2016}). A su vez, la introgresión (i.e. la transferencia de material genético de una especie a otra vía hibridación) ha sido documentada en un gran número de especies (Arnold, 1992; Rieseberg et Wendel, 1993; ^{Thompson et al., 2010}). En la tribu Andropogoneae se han detectado casos de hibridación interespecífica e intergenérica en géneros tales comoAndropogonL. (^{Norrmann, 2009}; ^{Nagahama et al., 2012}, 2013),BothriochloaKuntze,DichanthiumWillemet (^{Estep et al., 2014}),EriochrysisP. Beauv.(^{Killeen, 1990}; ^{Welker et al., 2016}),MiscanthusAndersson (^{Hodkinson et al., 2002})y SaccharumL. s.l. (^{Nair et al., 2005}; Aitken et al., 2007; Welker et al., 2015, 2017). EnSchizachyrium, aunque se habían detectado algunos especímenes con caracteres intermedios (Killeen, 1990, ^{Peichoto et al., 2015}), hasta el momento no se había documentado la ocurrencia de hibridación natural entre las especies. Las poblaciones deSchizachyriumaquí estudiadas fueron identificadas inequívocamente como pertenecientes aS. bimucronatum,S. sanguineumoS. tenerumsobre la base de sus características morfológicas. Sin embargo, el hallazgo de individuos en cada una de dichas especies con una proporción de sus genomas nucleares asignable a las otras especies, sugiere que en la historia evolutiva de dichas especies pudieron ocurrir eventos de hibridación seguida de procesos de introgresión o de poliploidización, considerando que enS. sanguineumyS. tenerumse detectaron citotipos poliploides (Peichoto et al., 2011). El análisis citogenético de estas poblaciones podría contribuir a dilucidar el origen alopoliploide de dichas especies. En el caso deS. sanguineum, nuestros resultados sustentarían la hipótesis de la ocurrencia de eventos de hibridación postulada por ^{Arthan et al. (2017}) a partir de análisis filogenómicos en Andropogoneae. Evidencias de eventos pasados de hibridación enS. sanguineumpuede observarse en la presencia de un individuo de esta especie con un haplotipo (haplotipo 2) de ADN cloroplástico genealógicamente más cercano a haplotipos pertenecientes a poblaciones deS. bimucronatumque a las poblaciones deS. sanguineum.

Asimismo, en las tres especies deSchizachyriumestudiadas, tanto los resultados del AMOVA como del análisis de agrupación Bayesiana evidenciaron que la variabilidad genética está estructurada y que el flujo génico entre las poblaciones de cada especie es restringido. Los patrones de estructuración genética de las especies pueden estar relacionados con las características de sus sistemas reproductivos (^{Holsinger, 2000}). En las gramíneas autógamas, en general, las poblaciones están constituidas por individuos homocigotos para la mayoría de losloci, por lo que constituyen una mezcla de líneas homocigotas, siendo la variabilidad genética intrapoblacional baja. Contrariamente, las poblaciones de plantas alógamas, poseen mayores valores de heterocigosis siendo la variabilidad genética intrapoblacional más elevada y sustancialmente mayor que la interpoblacional. Finalmente, en las especies con una estrategia mixta (con ambos sistemas reproductivos) la variabilidad genética es intermedia (^{Huff et al., 1993}). Por otra parte, en las especies apomícticas la variabilidad genética se encuentra particionada principalmente entre poblaciones y en menor grado dentro de las poblaciones, al igual que en las plantas autógamas (Nybom, 2004). La apomixis, además, está generalmente relacionada a la poliploidía ya que la mayoría de las plantas apomícticas son poliploides (^{Savidan, 2000}). Aunque enSchizachyriumse ha citado la presencia de apomixis apospórica enS. sanguineum(^{Carman et Hatch, 1982}) y algunas de las especies sudamericanas han sido documentadas con citotipos diploide y poliploide (^{Gould, 1956}; ^{Killeen, 1990}; ^{Peichoto et al., 2011}), hasta el momento, no se cuenta con información acerca de los sistemas reproductivos de las especies ni de los niveles de ploidía de las poblaciones aquí estudiadas. Sin embargo, pueden realizarse algunas inferencias a partir de los patrones de estructuración genética detectados y de la información citogenética disponible. EnS. bimucronatum, la mayor variabilidad genética detectada entre poblaciones, así como el hecho que las poblaciones estudiadas formaron grupos bayesianos diferentes y que en esta especie sólo se hallaron poblaciones diploides (Peichoto et al., 2011), sugieren que se trataría de una especie autógama. Los bajos niveles de heterocigosis esperada detectados en esta especie sustentan esta proposición y, además, sugieren que las poblaciones deS. bimucronatumestarían sujetas a procesos de endogamia o deriva genética. EnS. sanguineum, aunque las poblaciones de Corrientes presentan citotipos tetraploide, pentaploide y octoploide (Peichoto et al., 2011), la mayor variabilidad genética detectada entre individuos dentro de las poblaciones, sugiere que se trataría de una especie alógama. Además, aunque los valores de Ф_STevidencian que la diferenciación genética entre las poblaciones es alta, el hecho que los tres grupos bayesianos en los que se divideS. sanguineumincluyan algunos individuos de diferentes poblaciones, sugiere que las restricciones al flujo génico entre las mismas no serían absolutas. Finalmente, enS. tenerumque posee citotipos tetraploide y hexaploide (Peichoto et al., 2011), los valores intermedios de heterocigosis y de variabilidad genética observados sugieren que se trataría de una especie apomíctica o con un sistema reproductivo mixto. El análisis de los sacos embrionarios y/o la determinación del modo reproductivo mediante citometría de flujo podrían aportar información de interés para poner a prueba las hipótesis aquí planteadas acerca de las características de los sistemas reproductivos de las especies deSchizachyrium.

Asimismo, las especies deSchizachyriumaquí estudiadas son componentes, en muchos casos dominantes, de las comunidades de pastizales naturales y sabanas del NEA, los que actualmente están siendo amenazados por la conversión a plantaciones forestales y otros usos del suelo (^{Brown et al., 2006}). Dado que la caracterización genética de las especies constituye una herramienta muy valiosa para identificar áreas prioritarias para la conservación que contemplen el mantenimiento de la variabilidad genética y los procesos evolutivos (^{Mace et Purvis, 2008}), la información aquí obtenida podría contribuir al desarrollo de estrategias de conservación más efectivas de estas especies y de las comunidades que integran. Por otra parte, el análisis de la distribución de las variantes genéticas también puede contribuir a la detección de riesgos de erosión de la diversidad genética de las especies (^{Ji et Leberg, 2002}). En este sentido, las agrupaciones resultantes por métodos bayesianos, los valores de Ф_ST, así como la presencia de bandas y haplotipos exclusivos en las poblaciones de las especies deSchizachyriumestudiadas sugieren la existencia de unidades intraespecíficas con suficiente divergencia evolutiva (unidades evolutivas independientes, ESUs), las que requerirían ser conservadas de manera independiente. En particular,S. bimucronatumque es una especie endémica y que fue la especie que presentó la menor variabilidad genética y el mayor grado de estructuración genética entre las especies estudiadas, además de evidencias de que sus poblaciones estarían sujetas a procesos de endogamia y, en consecuencia, en mayor riesgo genético.