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Introducción
PetuniaJuss. pertenece a la familia Solanaceae, género endémico de América del Sur donde posee alrededor de 11 especies, con centro de diversidad en el sur de Brasil (Stehmann et Semir, 2005). Incluye hierbas perennes o anuales, erectas, postradas o decumbentes. El período de floración ocurre desde la primavera hasta fines de otoño, con flores simples o dobles, con pétalos de bordes ondulados y rectos; habitan en suelos bien drenados y con suficiente humedad, siendo tolerantes a la salinidad (Fries, 1911; Fornes et al., 2007; Stehmann et al., 2009).
En Argentina se encuentran siete especies dePetunia, una es endémica (Palchetti et al., 2020).
Petunia axillaris(Lam.) Britton, Sterns & Poggenb. yP. integrifolia(Hook.) Schinz & Thell., tienen amplia distribución, crecen en el sur de Brasil, Argentina, Uruguay (Wijsman, 1982) y son los taxones parentales del híbrido P. × hybrida Hort. ex E. Vilm., conocida vulgarmente como “petunia” o “petunia de jardín”. Petunia × hybrida es la especie floral, ornamental, de maceta, más cultivada en el mundo (Hamrick, 2005) debido a su versatilidad, el largo período de floración y la amplia disponibilidad de genotipos con colores y formas muy variadas. Actualmente es un producto en continuo mejoramiento, de gran interés para la floricultura dada la importancia económica que posee en el mercado mundial de plantas ornamentales (Fornes et al., 2007).
La floricultura en Argentina, ha comenzado a tomar importancia en provincias como Formosa, Santa Fe, Tucumán y Mendoza. El valor de la actividad florícola dentro de la economía nacional, no sólo se relaciona con la generación de divisas, sino también con una alta demanda de mano de obra especializada (Hashimoto, 2010). En la producción nacional de plantines anuales herbáceos,P.×hybridaes la especie más cultivada para comercialización (Barbaro et al., 2015). Dicho cultivo demanda una elevada aplicación de fertilizantes químicos, los que constituyen elementos básicos e imprescindibles para obtener la mejor calidad e incrementar el número de flores (Hoda et Mona, 2014). No obstante, se ha comprobado que el uso indiscriminado de insumos de síntesis química implica un costo monetario elevado, además de contaminar el suelo, reducir la biodiversidad, aumentar los riesgos de salinización, disminuir considerablemente las reservas energéticas del suelo y contaminar aguas superficiales y subterráneas (Dierksmeier, 2007). Atendiendo a esta situación se hace necesario evaluar alternativas de fertilización que resulten más económicas a los agricultores y ambientalmente sostenibles (Muñoz et Lucero, 2008). Especial énfasis ha cobrado, desde la década del ochenta, la utilización de fitohormonas, entre ellas los brasinoesteroides (BRs) con reconocidas propiedades para la protección de las plantas y el aumento en la producción agrícola (Seeta et al., 2002; Salgado et al., 2008). El uso de BRs en agricultura, es una alternativa segura que evita o reduce la aplicación de agroquímicos tóxicos, mejorando el desarrollo, rendimiento, calidad y tolerancia de las plantas (Coll et al., 2015). Los BRs son reguladores del crecimiento de las plantas involucrados en una amplia variedad de procesos a nivel celular y molecular. La aplicación de BRs induce un amplio rango de respuestas por parte de las plantas, incluyendo un incremento en la expansión celular de las hojas, aumento en la elongación del tallo, crecimiento del tubo polínico, desenrollamiento de hojas, reorientación de las microfibrillas de celulosa, formación de tejido conductor, en la fotomorfogénesis, en la división celular, estimulación o inhibición de la rizogénesis, inducción de la biosíntesis de etileno, polarización de la membrana y poseen un gran potencial para aumentar el desarrollo y crecimiento floral (Runkova et al., 1999; Hu et al., 2000; Nemhauser et Chory, 2004; Singh et Shono, 2005; Reyes et al., 2008; Hernández Silva et García-Martínez, 2016).
Los brasinoesteroides juegan un papel importante en la tolerancia al estrés biótico y abiótico, tales como la resistencia a enfermedades, tolerancia a la sequía, salinidad, calor, frío, pesticidas y metales pesados, entre otros (Bajguz et Hayat, 2009; Gomes, 2011; Vriet et al., 2012); no tienen demasiado efecto cuando las condiciones de crecimiento son óptimas. Estudios toxicológicos demuestran que estos compuestos no son genotóxicos, ni ecotóxicos y tampoco antigenotóxicos (Díaz et Fonseca, 1999).
Otra respuesta de las plantas a los BRs, incluye efectos sobre los sistemas de señalización para la defensa contra insectos, hongos, bacterias y virus patógenos (Clouse, 1996; Izquierdo, 2011; Coll et al., 2015; Furio et al., 2019 a). El cierre estomático y la mayor deposición de calosa y lignina en la pared celular, constituyen marcadores bioquímicos de mecanismos de defensa, son barreras físicas contra la penetración de patógenos invasivos (Wuyts et al., 2006; Asselbergh et al., 2007; Ferreira et al., 2007; Galletti et al., 2008; Millet et al., 2010). Estudios en plantas de papa y tabaco han descripto la relación entre BRs y la activación de mecanismos de defensa, evidenciando la disminución de infecciones provocadas por microorganismos patógenos (Khripach, 1999; Roth et al., 2000; Nakashita et al., 2003). Así mismo, Núñez Vázquez et al. (2014), reconocen que los BRs regulan la expresión de muchos genes que gobiernan varios procesos biológicos, como el cierre estomático.
Los antecedentes relacionados al uso de BRs en floricultura son escasos en comparación con los de horticultura; los que se refieren a gladiolos, tulipanes, orquídeas, claveles y rosas, evidenciando incremento en número de flores y bulbos, y en la longitud y grosor de tallos y botones florales (Runkova et al., 1999; Suarez, 2007; Salgado et al., 2008; Castilla Valdés et González Vega, 2011; Soria Llerena, 2011). En Tucumán se realizaron ensayos con biofertilizantes y bioinsumos aplicados en la producción de plantas ornamentales y hortícolas, obteniéndose resultados alentadores (Salazar et al., 2016; Toffoli et al., 2018; Furio et al., 2019a, b).
A fin de contribuir en el conocimiento y la tecnología para la producción de plantas ornamentales, el objetivo de este trabajo fue evaluar la respuesta agronómica y estructural enPetunia×hybridaante la aplicación de BRs.
Materiales y Métodos
El ensayo se llevó a cabo en la Estación Experimental Agropecuaria Famaillá del INTA (27°03´S; 65°25´W, 363 m s.n.m.), en la provincia de Tucumán, Argentina, bajo condiciones de invernadero.
Material vegetal y brasinoesteroides
Se utilizaron plantines dePetunia×hybridaSerie Dreams® de un mes de edad, proveniente de viveros comerciales de la provincia de Buenos Aires. Los que fueron trasplantados en macetas de 900 ml conteniendo sustrato GrowMix Standard®, el día 20 de abril 2017. Transcurrido 15 días del trasplante se efectuó la aplicación de la primera dosis de los BRs 24-Epibrasinólida (EP24) y un análogo epirostánico derivado de este, denominado Biobras (BB16), mediante aspersión foliar de ambos BRs a una concentración de 0,1 mg/L (3 de mayo). Ambos brasinoesteroides fueron cedidos por el Laboratorio de Productos Naturales de la Facultad de Química de la Universidad de La Habana, Cuba. La segunda aplicación se realizó a los 20 días posteriores al trasplante (23 de mayo). Para las plantas controles se utilizó agua destilada.
Diseño experimental
El ensayo consistió en los siguientes tratamientos: i) plantas tratadas con EP24, ii) plantas tratadas con BB16 y iii) plantas sin tratamiento ni fertilización (testigo absoluto, TA). En todos los tratamientos se utilizaron 10 plantas, cada una corresponde a una unidad experimental.
Los ensayos tuvieron un diseño completamente aleatorizado. Cada tratamiento estuvo constituido por 10 repeticiones para determinar los parámetros destructivos (biomasa y área foliar) y 20 repeticiones para determinar los parámetros no destructivos (índice de verdor y número de flores).
Evaluación de la respuesta agronómica frente a la aplicación de BRs
Se realizó en los distintos períodos fenológicos de la planta (foliación, floración, y senescencia), las variables medidas fueron:
Índice Índice de verdor: se determinó mediante el contenido de clorofila, en tres hojas al azar por individuo/tratamiento, a los 35, 45 y 60 días posteriores al trasplante bajo condiciones de invernadero. Se utilizó el medidor de clorofila SPAD Minolta 502 (Güler et al., 2006).
Biomasa: se determinó el peso fresco y seco de raíz y parte aérea, a los 35 y 60 días posteriores al trasplante, bajo condiciones de invernadero. Se utilizó balanza analítica y estufa de secado con ventilación forzada.
Área foliar: se midió a los 35 y 60 días posteriores al trasplante en invernadero. Se tomaron cinco hojas maduras por cada individuo, las que fueron escaneadas y posteriormente analizadas mediante el uso del Software ImageJ (http://rsbweb. nih.gov/ij/), calculándose el área de las mismas. Luego de determinar el área específica de la hoja (AEH) como Ad/Wd, en donde Ad es el área y Wd es el peso seco de las hojas, se infirió el área foliar como Af=AEH x Wb.
Número de flores: se tomó el dato de primera flor abierta visible en cada maceta de seguimiento. El número de flores se cuantificó semanalmente por individuo/ tratamiento, durante 10 semanas (Fig. 1A). Transcurridos los 60 días del inicio del ensayo, se realizó el trasplante bajo condiciones a campo, ubicando las mismas en los bordos a tres bolillos, y se continuó con el conteo de flores bajo condiciones de campo (Fig. 1B).Número de flores: se tomó el dato de primera flor abierta visible en cada maceta de seguimiento. El número de flores se cuantificó semanalmente por individuo/tratamiento, durante 10 semanas (Fig. 1A). Transcurridos los 60 días del inicio del ensayo, se realizó el trasplante bajo condiciones a campo, ubicando las mismas en los bordos a tres bolillos, y se continuó con el conteo de flores bajo condiciones de campo (Fig. 1B).
Fig. 1. Petunia × hybrida. A: Plantas en invernáculo, a los 30 días del inicio del ensayo. B: Plantas trasplantadas en camellones bajo condiciones de campo a tres bolillos a los 60 días del inicio del ensayo. Escalas: A, 30 µm; B, 15 µm.
Evaluación de los cambios estructurales frente a la aplicación de BRs
Se trabajó con 5 individuos, de cada uno se extrajeron 5 hojas tratadas con ambos BRs (EP24 y BB16) y el control (TA). Las muestras foliares se tomaron 30 días posteriores a la segunda aplicación de los BRs, fueron fijadas en FAA (1/1/8 v/v/v formol: ácido acético glacial: etanol 80%) y posteriormente procesadas. Las variables analizadas fueron:
Cierre estomático: las hojas fueron diafanizadas según la técnica de Dizeo de Stritmatter, y posteriormente teñidas con cristal violeta (D´Ambrogio de Argüeso, 1986). Los preparados fueron montados en agua glicerina (1:1). Se tomaron, al azar, microfotografías de 10 campos ópticos (63x), de ambas superficies foliares. Se utilizó la cámara digital (Canon, Power Shot A620, 7.1 M.P.), incorporada al microscopio óptico (Axiostar Plus, Carl Zeiss, Göttingen, Alemania). Posteriormente, para calcular la apertura estomática se utilizó el software ImageJ versión 1.44 (NIH) (https://imagej.nih.gov./ij/).
Deposición de calosa: se realizaron cortes transversales del sector medio de la hoja, los que fueron teñidos con azul de anilina de acuerdo al “Método III” de Martin (1959), con modificaciones propias, donde los cortes fueron tratados con lavandina hasta clarificación, posteriormente lavados y teñidos con azul de anilina al 0,05% en KH2PO4 (0,15M) y mantenidos en oscuridad durante 2 horas, y posterior observación con microscopía de epifluorescencia (Olympus BX43, U-TVO 5xc-3, filtro UV 365 nm). Por cada muestra se realizaron cortes seriados de 20 µm a 25 µm de espesor y se distribuyeron al azar en 5 portaobjetos con 10 cortes en cada uno. Cada corte fue examinado y fotografiado. La deposición de calosa se clasificó como débil o brillante.
Deposición de lignina en elementos del xilema: para la detección de lignina se utilizaron dos métodos cualitativos, microscopía de epifluorescencia y prueba específica de floroglucina (D’ Ambrogio de Argüeso, 1986). Para microscopía de epifluorescencia se realizaron cortes transversales del sector medio de la hoja mediante la técnica de “mano libre” (D’ Ambrogio de Argüeso, 1986), y se tomaron microfotografías de las paredes celulares autofluorescentes.
Para la prueba de floroglucina los cortes transversales del sector medio de la hoja fueron clarificados con lavandina, luego lavados con agua destilada, se aplicó floroglucina al 1% en solución alcohólica y se sometieron a la llama directa, posteriormente se adicionó ácido clorhídrico al 25% (D’ Ambrogio de Argüeso, 1986). Las paredes celulares lignificadas fueron observadas por la intensidad de la coloración rojo violáceo. Las microfotografías fueron tomadas en microscopio óptico (Axiostar Plus, Carl Zeiss, Göttingen, Alemania) equipado con cámara digital (Canon A620, Power Shot 7,1 M.P.). El número de preparados y cortes analizados fue idéntico a lo mencionado para calosa.
Análisis estadístico
Los datos de las variables índice de verdor, biomasa, área foliar, número de flores y cierre estomático se analizaron con el programa InfoStat (Di Rienzo et al., 2013), y se aplicó el análisis de la varianza seguido de la prueba de Tukey (α > 0,05).
Resultados
Respuesta agronómica de las plantas frente a la aplicación de BRs
- Índice de verdor: las plantas tratadas con brasinoesteroides evidenciaron similares valores al control, por lo cual no hubo diferencia significativa entre tratamientos y estadios evaluados (Tabla 1).
Tabla 1 Índice de verdor en plantas de Petunia × hybrida tratadas con BRs (EP24, BB16). Medias ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas según la prueba de Tukey (p > 0,05).
- Biomasa: el peso fresco aéreo de las plantas tratadas con BB16, a los 35 días del trasplante, evidenció un mayor valor, con diferencia significativa en relación al tratamiento con EP24. Mientras que el peso seco de raíz en plantas tratadas con EP24 mostró un mayor valor a los 60 días del trasplante, con diferencia significativa en relación al tratamiento de control (Tabla 2).
Tabla 2 Biomasa en plantas de Petunia × hybrida tratadas con BRs (EP24, BB16). Peso fresco partes aéreas (PFPA); peso fresco raíz (PFR); peso seco partes aéreas (PSPA); peso seco raíz (PSR). Medias ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias estadísticas según la prueba de Tukey (p > 0,05).
- Área foliar: las plantas tratadas con brasinoesteroides evidenciaron similares valores a las plantas controles en todos los períodos analizados, por lo cual no hubo diferencia significativa entre tratamientos (Tabla 3).
Tabla 3 Área foliar en plantas de Petunia × hybrida tratadas con BRs (EP24, BB16). Medias ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias estadísticas según la prueba de Tukey (p > 0,05).
-Número de flores: las plantas TA mostraron un mayor número de flores en la segunda semana de floración, con diferencia significativa en relación a los tratamientos con BRs. En la quinta, sexta y séptima semana (semanas correspondientes a la última en invernadero y las dos primeras a campo) las plantas tratadas con EP24 mostraron mayor número de flores, con diferencia significativa (Tabla 4), respecto a los restantes tratamientos.
Tabla 4 Número de flores en plantas Petunia × hybrida tratadas con BRs (EP24, BB16), en invernadero y a campo. Medias ± error estándar. Letras diferentes indican diferencias estadísticas según la prueba de Tukey (p > 0,05).
Respuesta estructural de las hojas frente a la aplicación de BRs
Cierre estomático: los estomas de la superficie abaxial de las plantas tratadas con EP24 evidenciaron menor cierre estomático, y diferencia estadística respecto del control (Fig. 2).
Fig. 2. Petunia × hybridaestomas de epidermis foliar abaxial. A: Testigo absoluto (TA). B: Tratamiento con BB16. C. Tratamiento con EP24. D: Gráfico de barras de apertura estomática según tratamientos. Escalas: A-C, 30 µm.
Deposición de calosa: las deposiciones de calosa en plantas tratadas y plantas controles fueron observadas en las placas cribosas del floema de los haces vasculares de la vena principal. Las plantas controles y las tratadas con BB16 expusieron menor deposición de calosa, demostrada por una débil fluorescencia (Fig. 3A, B); mientras que las plantas a las que se aplicó EP24 presentaron mayor deposición de calosa, evidenciada por placas cribosas más brillantes (Fig. 3C).
Deposición de lignina: la acumulación de lignina en los elementos del xilema en plantas tratadas y plantas controles, fue observada tanto con microscopio de epifluorescencia (Fig. 3A-F) como en microscopio óptico (Fig. 3G-I). En ambos casos, las plantas tratadas con EP24 evidenciaron la mayor deposición de lignina en los vasos del xilema debido a la intensidad de autofluorescencia (Fig. 3F) y de coloración con floroglucina (Fig. 3I).
Fig. 3. Deposición de calosa y lignina en los haces vasculares de hojas dePetunia × hybrida. Las fotomicrografías ubicadas a la izquierda (A, D y G) corresponden a plantas controles, las del centro (B, E y H) y las de la derecha (C, F e I) a plantas tratadas con BB16 y EP24, respectivamente. A-C: Cortes longitudinales mostrando deposición de calosa en placas de tubos cribosos (flechas). D-I: Cortes transversales del haz vascular central. D-F: Lignina en elementos del xilema, observación con microscopio de epifluorescencia. G-I: Lignina en elementos del xilema, tinción con floroglucina. Escalas: A y B, 15 µm; C, 10 µm; D-G e I, 30 µm; H, 40 µm.
Discusión
La respuesta agronómica y estructural dePetunia× hybridaante la aplicación de brasinoesteroides evidenció resultados diferentes entre los tratamientos. De acuerdo a las variables agronómicas analizadas se observó que las plantas tratadas con BB16 y EP24, mostraron una mayor producción de biomasa en relación al TA, en diferentes etapas del ensayo. La aplicación de EP24 produjo un aumento tanto de biomasa como en el número de flores y una respuesta positiva en la inmunidad de las plantas evidenciada por deposición de calosa y lignina en los haces vasculares de la vena principal de la hoja; lo que permite interpretar la influencia de estos bioactivos sobre la fotosíntesis y la potencial capacidad de la planta para crecer. Resultados similares en plantas ornamentales, fueron mencionados por Suárez (2007), quien al incorporar BB16 en orquídeas, observó un incremento en raíces y en el número de pseudobulbos o tallos, además vio favorecida la coloración de las plantas y la calidad de las flores. En este trabajo las plantas deP.×hybridatratadas con EP24, evidenciaron mayor número de flores durante la quinta, sexta y séptima semana. Salgado et al. (2008) observaron emergencia temprana de yemas florales, incremento del número de flores, aumento del número (68%) y masa (85%) de bulbos y yemas bulbíferas en gladiolos y tulipanes, cuyos bulbos fueron embebidos en una solución de epibrasinólida. Khipach et al. (1991) y Rosabal-Ayan et al. (2013) observaron mayores rendimientos en plantas de poroto, arveja y soja tratadas con BB16 y EP24. Ikekawa et Zhao (1991) han informado incrementos en el número de espigas en el cultivo del trigo al que se aplicó EP24.
En cuanto a las respuestas de tipo estructural, en este trabajo las plantas tratadas con EP24 mostraron menor apertura estomática. A diferencia de lo observado por Furio et al. (2019a), quienes informaron que la aplicación de EP24 en plantas de frutilla cv. ‘Pájaro’, no mostró diferencia en la apertura de estomas, mientras que BB16 causó un notable cierre de los mismos. Existen antecedentes, como el de Choudhary et al. (2012) y Núñez Vázquez et al. (2014), quienes plantean que la interacción entre los BRs y el ácido abscísico (ABA), regula la expresión de genes que gobiernan varios procesos biológicos, entre ellos el cierre estomático.
Las plantas deP.×hybridatratadas con EP24 mostraron una mayor deposición de los polisacáridos calosa y lignina, en las paredes celulares de los haces vasculares de la vena principal de las hojas. Se evidencia entonces una respuesta positiva en la inmunidad de las plantas, actuando la pared celular como barrera física importante ante el ataque de patógenos microbianos. Resultados similares fueron observados por Furio et al. (2019a) en plantas de frutilla cv. ‘Pájaro’, ante la aplicación del BB16. Dicha diferencia podría estar influenciada por la propia naturaleza, anatomía, fisiología y genética de las plantas, con la consiguiente sensibilidad de las mismas frente al efecto de los BRs.
Conclusión
La aplicación foliar con los BRs EP24 y BB16 enPetunia× hybridaprodujo cambios agronómicos y estructurales favorables, en relación a las plantas control. Siendo las plantas tratadas con EP24 quienes evidenciaron mayor biomasa, producción de flores y modificaciones estructurales. Esto sugiere que EP24 ejerce un efecto sinérgico en el cultivo de esta planta ornamental en relación con la sanidad, calidad y rendimiento al momento de la producción.
Por lo tanto, los BRs podrían considerarse una alternativa biotecnológica para mejorar la producción de flores, y como biofertilizante en reemplazo de productos de síntesis química (Seeta et al., 2002; Salgado et al., 2008; Coll et al., 2015).
