ARTÍCULOS ORIGINALES

Micropropagación de Cissus tiliacea, planta del sur del estado de México

Micropropagation of Cissus tiliacea, plant native of the South of the state of Mexico

 

José Humberto Jiménez-Martínez ¹, Omar Franco-Mora ¹, Andrés González-Huerta ², Álvaro Castañeda-Vildózola ² y María de Guadalupe Gutiérrez-Martínez ²

¹Laboratorio de Horticultura. Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Fitomejoramiento. Facultad de Ciencias Agrícolas. Universidad Autónoma del Estado de México. Campus Universitario El Cerrillo. Toluca. México. C. P. 50200. ofrancom@uaemex.mx
²Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Fitomejoramiento. Facultad de Ciencias Agrícolas. Universidad Autónoma del Estado de México. Campus Universitario El Cerrillo. Toluca. México. C. P. 50200.

 

Recepción: 17/08/2010
Aceptación: 15/09/2011

 

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RESUMEN

La demanda creciente por alimentos orgánicos presenta ventas por encima de los cinco mil millones de dólares por año a nivel mundial. Esta demanda también se extiende a los países en desarrollo como es el caso chileno, el cual exporta el 90% de su producción, generando un mercado interno poco desarrollado para este tipo de productos. La presente investigación intenta identificar los constructos que caracterizan los potenciales consumidores de alimentos orgánicos. Para el desarrollo del estudio se aplicó una encuesta a una muestra de 422 consumidores de la Región del Maule en Chile central (N. C. = 95,5%; e = 3,0%). La información posteriormente fue analizada a través de la técnica multivariante denominada análisis factorial de componentes principales. Los resultados de la investigación revelan la existencia de cuatro dimensiones o constructos: (1) beneficios de la agricultura orgánica; (2) alimentación sana; (3) estilos de vida y (4) atributos de los productos orgánicos. Estas dimensiones influyen en la actitud e intención de compra por parte de los consumidores hacia los alimentos orgánicos y son elementos clave para formular estrategias de comercialización para productos orgánicos.

Palabras clave: Conservación; Cultivo in vitro; Recursos genéticos; Segmento nodal; Vitaceae.

ABSTRACT

The growing demand for the consumption of organic foods at worldwide level presents sales increasing by over five thousand million dollars per year. Demands extended to development countries like it is the Chilean case, which exports 90% of its production getting an internal market with low development for this type of products. The research tries to identify the constructs to characterize the potential consumers of organic foods. A survey was applied to 422 consumers to carry out the research in the Maule Region, central Chile (C. I. = 95.5%; e = 3.0%). The Information was analyzed through multivariante technic denominated factor analysis of principal components. The main results of the research reveal the existence of four dimensions or constructs, corresponding to: (1) benefits of the organic agriculture; (2) healthy feeding; (3) lifestyles; (4) attribute of organic foods. These four factors influence in the attitude and purchase intention for the consumers toward the organic foods. In addition being key elements when formulating market strategies for organic products.

Keywords: Consumers; Factor analysis; Organic foods.

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INTRODUCCIÓN

La familia Vitaceae comprende alrededor de 165 géneros y 1.370 especies, las cuales están distribuidas a lo largo de los trópicos ⁽²¹⁾. Lombardi ⁽¹¹⁾ indicó que en el neo-trópico se encuentran cuatro géneros en forma natural: Ampelocissus Planch., Ampelopsis Michx., Cissus L. y Vitis L. El género Cissus es el más grande, con 350 especies distribuidas a través de África, América, Asia y Australia. En México, se llevan a cabo trabajos para conservar y caracterizar plantas nativas de la familia Vitaceae ⁽⁴⁾; además, se busca clarificar su potencial farmacológico. Tobar-Reyes et al. ⁽²⁷⁾ determinaron variabilidad de distintos genotipos de vid silvestre ^{(Vitis spp.)} en sus contenidos foliares de resveratrol, un polifenol que posee propiedades antiinfamatorias, antioxidantes y antifúngicas con acción preventiva en enfermedades del corazón. En Cissus también existen moléculas con potencial farmacológico como esteroles, quininas, compuestos fenólicos, antocianinas, saponinas y favonoides ⁽²²⁾.

Cissus tiliacea Kunth se ha reportado en las localidades de Tequisquiapan y Temascaltepec en los estados de Querétaro y México, respectivamente; también en localidades de los estados de Guanajuato, Hidalgo, Jalisco, Michoacán, Distrito Federal y Puebla, en donde es popularmente conocida como "tilia", "sirimo", "tripa de vaca" y "cola del diablo" ⁽²³⁾. Es comercializada en los mercados por sus flores. Por tener características de madera suave y ligera, se usa para hacer jícaras, cucharas y bateas. Se tienen registros de que el fruto es utilizado para la elaboración de vino artesanal y, en general, es empleada en la medicina tradicional, recomendada en infusiones para controlar la excitación nerviosa ⁽¹²⁾.

En el estado de México, específicamente en el municipio de Ocuilan, se han ubicado ejemplares de la especie C. tiliacea, a altitudes que van desde los 1.660 a 1.978 m. Dicho territorio forma parte de la Sierra Madre del Sur, el eje volcánico y la cuenca del Balsas, esencialmente de las sierras y valles guerrerenses. La temperatura media anual de la región es de 16,51 a 19,50°C; cuenta con una precipitación media anual de 1.150 mm y un tipo de vegetación de bosque encino ^{(Quercus ilex L.)} con vegetación secundaria arbustiva y herbácea ⁽²⁵⁾. En las últimas décadas se ha registrado en la región una alta tasa de deforestación, debido al impulso a las actividades agrícolas y ganaderas, además de la construcción de centros recreativos, acciones que han deteriorado y transformado los hábitats de la flora y fauna ⁽⁶⁾.

El cultivo in vitro se ha extendido para abarcar el cultivo aséptico de tejidos, así como el de células y órganos. Es una herramienta de gran importancia empleada en la biotecnología para incrementar poblaciones vegetales de interés, para elaborar y extraer productos de origen natural (i.e. almidón, aceites vegetales, etc.). También se utiliza para la fabricación de sustancias útiles en la agroquímica, el mejoramiento de procesos agrícolas, en la ingeniería genética así como en la conservación de recursos ftogenéticos. De esta técnica se deriva la micropropagación, enfocada principalmente al incremento acelerado del número de plantas derivadas por genotipo en superficies pequeñas y a bajo costo. Esta técnica, a largo plazo, podría apoyar la recuperación de zonas altamente afectadas por la gran actividad antrópica ⁽¹⁸⁾.

Actualmente no se cuenta con registros de la micropropagación de C. tiliacea, especie promisoria para su análisis farmacológico y que, por ende, requiere ser conservada como un recurso ftogenético. Además, la micropropagación es una etapa importante para el potencial establecimiento de un banco de germoplasma in vitro. Sin embargo, debe experimentarse para obtener la técnica que incremente el potencial regenerativo de cada especie. Por ello, en la presente investigación se tuvo como objetivo determinar una técnica de micropropagación para C. tiliacea.

MATERIALES Y MÉTODOS

Planta madre o fase cero

De acuerdo con la metodología de Franco-Mora et al. ⁽⁴⁾, se colectó el material de C. tiliacea y con la ayuda de un GPS (GPS 12, Garmin, USA) se registraron las coordenadas del bosque de Ocuilan, Estado de México. Ejemplares de C. tiliacea se depositaron en el herbario Eitzi Matuda CODAGEM (Comisión Coordinadora para el Desarrollo Agrícola y Ganadero del Estado de México), y en el invernadero de la colección de trabajo de Vitis de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma del Estado de México (FCA/UAEM) se enraizaron estacas y a partir de ellas se obtuvieron los explantes para el establecimiento in vitro.

Establecimiento in vitro o fase 1

De la planta madre se extrajeron tanto ápices en activo crecimiento, como tallos. En el laboratorio de Biotecnología de la FCA/UAEM se disectaron los segmentos nodales, removiendo previamente las hojas y zarcillos, dejando sólo el ápice y segmentos nodales. Éstos se lavaron durante 25 minutos con una solución de 5 g L^-1 de detergente comercial (Roma) en agitación constante.

Posteriormente, los segmentos nodales fueron sumergidos en hipoclorito de sodio al 10% por 12 minutos y se enjuagaron tres veces con agua destilada y estéril. Luego, con la finalidad de contrarrestar al máximo el efecto de la oxidación del tejido vegetal, se aplicó una solución antioxidante, la cual constó de una mezcla de ácido cítrico 150 mg L^-1 y ácido ascórbico 100 mg L^-1 en la cual se sumergieron los explantes y se fueron sacando conforme se empleaban.

Los segmentos nodales se colocaron en tubos de ensayo de 15 cm de largo y 2,5 cm de diámetro, empleando dos medios de cultivo: Murashige y Skoog (MS) ⁽¹⁵⁾ y Lloyd y McCown (WPM) ⁽¹⁰⁾, adicionados con 0,5 mg L^-1 de benziladenina (BA), 20 g L^-1 de sacarosa, 0,5 mg L^-1 de tiamina y 7 g L^-1 de agar. Los medios se ajustaron a pH 5,7 y se esterilizaron en autoclave a 120°C, durante 20 minutos. Una vez establecido el explante, los cultivos se mantuvieron a 25 ± 2°C con un fotoperíodo de 16 horas. Después de dos meses se determinó el número de brotes, vigor del explante, formación de callo, oxidación de callo, número de raíces, número de hojas, número de nudos y ápices oxidados.

En lo que respecta a la medición del vigor del explante, se asignaron valores con base a una escala categórica: 0 para los explanes oxidados ya muertos, 1 para los que presentaban clorosis, 2 para los que presentaron un buen tamaño y desarrollo y 3 para aquellos explantes que sobresalían de todos los anteriores. En el caso de la formación de callo, de igual manera se realizó una escala en la cual el valor de 0 era ausencia de callo, 1 significaba presencia de callo pequeño, 2 la formación de callo de tamaño regular y 3 la formación de callo mayor.

Multiplicación o fase 2

Se utilizaron segmentos nodales (basal, medio y ápices), denominando basal al segundo nudo de la vitro planta, medio al nudo intermedio y ápice a la parte apical de la planta. Los explantes fueron transferidos a WPM con diferentes concentraciones de BA: 0; 0,5; 1,0; 1,5 y 2,0 mg L^-1 suplementados con todas las características mencionadas en los medios anteriores.

Enraizamiento o fase 3

Los explantes extraídos de las etapas anteriores se establecieron en el medio MS adicionado con alguna de tres auxinas diferentes: ácido naftalen-1-acético (ANA), ácido indol-3-butírico (AIB) y ácido indol-3-acético (AIA) a 0,5 mg L^-1, respectivamente, con la finalidad de promover la formación de raíces. Las variables a evaluar fueron: número de raíces primarias, número de raíces secundarias, longitud de raíz principal y diámetro de raíz principal, las dos anteriores en milímetros. Para realizar las mediciones correspondientes a longitud y diámetro de raíz principal se empleó el programa ImageJ® y una cámara digital con la cual se tomaron fotografías a las raíces y a un estándar dimensional.

Análisis estadístico

A los datos obtenidos se les realizó un análisis de varianza (ANOVA), para las etapas 1 y 3. En la etapa 2 se llevó a cabo un ANOVA bifactorial (concentraciones de BA y segmentos nodales) y posteriormente se efectuó un ANOVA considerando los dos factores de estudio como tratamientos independientes.

El diseño experimental empleado en las tres etapas de la investigación fue completamente al azar con quince repeticiones por tratamiento; cuando el valor de F fue significativo se efectuó una comparación de medias con la prueba de Tukey (p < 0,05).

RESULTADOS

Durante la fase 1, los dos medios de cultivo, MS y WPM, indujeron la regeneración de un brote por segmento nodal. Los explantes formaron de 3,4 a 4,6 hojas y de 3,6 a 4 nudos; además, ambos medios indujeron la formación de raíces adventicias. La formación de callo solamente se observó en los explantes colocados en el medio WPM (figura 1); en los callos formados se presentó 33% de oxidación. Por otro lado, se registró la presencia de 10 y 23% de ápices oxidados en los medios MS y WPM, respectivamente y 17,3% de contaminación en los dos medios de cultivo.

Figura 1. Comportamiento de Cissus tiliacea, propagada en dos medios de cultivo. Los datos son la media de 15 repeticiones ± el EE. Unidades arbitrarias para vigor y callo y unidades para el resto de las barras.
Figure 1. Behavior of Cissus tiliacea propagated in two medium formulations. Data are the mean of 15 replications ± the SE. Arbitrary units for vigor and callus, and units for the other bars.

En la etapa de multiplicación, en el análisis bifactorial, el tipo de explante empleado (basal, medio y apical) no presentó diferencias significativas, pero sí la dosis de BA. Lo anterior se corroboró en el análisis de un factor, específicamente en el segmento apical la concentración de 1,5 mg L^-1 fue la que generó un mayor número de nudos. Además, existió una interacción por los factores BA y el tipo de segmento nodal empleado en la siembra, para el número de raíces (tabla 1).

Tabla. Efecto de la benzyladenina (BA) y el segmento nodal en el establecimiento in vitro de Cissus tiliacea.
Table. Effect of the benzyladenine (BA) and the type of shoot in the establishment in vitro of Cissus tiliacea.

Con respecto a las diferentes concentraciones de BA, se observó que para el número de brotes no hubo diferencias significativas, registrando de 0,8 a 1,6 brotes por explante. Sin embargo, 0 y 0,5 mg L^-1 BA fueron las que generaron mayor valor, de 2,2 a 2,6 en la escala de vigor de explante. Una mayor formación de callo se observó a 1,5 y 2,0 mg L^-1 BA, seguido de las concentraciones a 0,5; 1,0 y 0 mg L^-1; en general, la presencia de oxidación en el callo fue mínima. Para raíces se presentaron diferencias significativas en las concentraciones de 0 y 0,5 mg L^-1 de BA con respecto al resto de las concentraciones, ya que permitieron el desarrollo de 1,2 a 1,6 raíces adventicias por brote. Pese a que las diferencias no fueron significativas en número de hojas y nudos, éstas presentaron rangos de 2,8 a 6 hojas y 2,2 a 4,2 nudos por explante, respectivamente (tabla).

En la etapa de enraizamiento, entre las tres auxinas no existieron diferencias significativas en el número de raíces primarias, regenerándose de 2,6 a 3,6 raíces adventicias por brote. Por otro lado, ANA indujo 12,7 raíces secundarias, diferenciándose (p < 0,05) de AIB y AIA.

También la longitud de la raíz se vio infuenciada por el tipo de auxina empleada: con AIB se logró una mayor elongación (p < 0,05), seguida de ANA y AIA. No obstante, con ANA se obtuvo un mayor diámetro (p < 0,05) en la raíz principal con 3,7 mm, seguido de AIB y AIA (figura 2).

Letras distintas en cada variable indican diferencias significativas entre tratamientos al p < 0,05. Values with different letter in each variable shown differences among treatments (p < 0.05).

Figura 2. A) Número de raíces principales y secundarias de Cissus tiliacea cultivada in vitro con tres auxinas diferentes. B) Longitud de raíz y diámetro de raíz principal de Cissus tiliacea cultivadas in vitro con tres auxinas diferentes.
Figure 2. A) Number of main and secondary roots of Cissus tiliacea cultivated whit three different auxins. B) Longitude and diameter of the main root of Cissus tiliacea cultivated with three different auxins.

DISCUSIÓN

No existió diferencia notable en el uso de dos medios de cultivo, MS y WPM, para micropropagar C. tiliacea. Las diferencias en la formación de callo pudieron deberse a los macro-nutrimentos presentes y el potencial osmótico en los diferentes medios de cultivo. La fuente carbonada del medio, que actúa como fuente energética y en algunos casos como regulador osmótico, promueve la formación de callo ⁽²⁰⁾. Molinos et al. ⁽¹⁴⁾ señalan -0,230 y -0,065 MPa de potencial osmóticos en MS y WPM, respectivamente, mientras que Santos et al. ⁽²⁴⁾ indicaron que para inhibir la deformación del material inicial y promover una compactación de los brotes, se debe inducir un ligero déficit hídrico mediante la adición al medio de agentes osmóticos que atrapen las moléculas del agua y, por tanto, reduzcan el potencial de agua en el medio.

Por otro lado, la relación Ca²⁺ / K+ presente en MS es 1:6,7 y en WPM es 1:0,4 lo cual es de gran importancia en el balance iónico y potencial osmótico del medio de cultivo; ambos factores determinantes en el crecimiento de las vitro plantas ⁽¹⁴⁾. Bretón et al. ⁽³⁾ señalaron que el aumento de la dosis de cobre en el medio de cultivo MS permitió incrementar la producción de callos verdes, fotosintéticamente activos, en lino (Linum usitatissimun L.).

La presencia de oxidación en los ápices pudo deberse a los problemas asociados con deficiencias de Ca²⁺ ya que en especies leñosas existe la baja movilidad del ión ⁽¹⁴⁾. Por su parte, Sha et al. ⁽²⁶⁾ mencionaron que en la mayoría de los trabajos realizados con vid, miembro de Vitaceae, al igual que Cissus, ha sido frecuente la presencia de necrosis apical propiciada por desbalances iónicos y relaciones nutricionales.

El efecto estimulante de las citocininas en la proliferación y crecimiento de brotes en especies de Vitaceae es bien conocido. Guerrero et al. ⁽⁵⁾ propagaron dos portainjertos de vid (Paulsen 1103 y Vr 04343) y encontraron la necesidad de adicionar 6-benzylaminopurina (BAP) en el medio MS, para obtener vástagos y hojas. En la presente investigación, las concentraciones de BA empleadas en la etapa de multiplicación de C. tiliacea permitieron una ligera regeneración de brotes por explante. Esta respuesta difere del incremento en brotes por explante de Vitis vinifera L. cv. Napoleón, empleando BA en concentraciones mayores de 1,5 mg L^{-1 (7)}. Como es bien sabido, el genotipo de las plantas infuye significativamente en la respuesta morfogenética en el cultivo in vitro ⁽²⁾. Además, la dosis y la combinación de reguladores del crecimiento pueden infuir en los resultados esperados en cada especie estudiada. Olivera-Ortega et al. ⁽¹⁶⁾ señalaron que los requerimientos del tipo y concentración de citocininas son extremadamente variables y dependen también del contenido endógeno en cada especie. Marulanda et al. ⁽¹³⁾ mencionaron que el balance auxina-citocininas es determinante en el coeficiente de multiplicación, por lo que al lograr un balance adecuado es posible alcanzar elevadas tasas de proliferación. La realización de nuevos trabajos en los cuales se evalúen mayores concentraciones de BA, además de combinaciones con auxinas, será necesaria para mejorar la eficiencia de multiplicación in vitro de C. tiliacea.

Las vitro plantas de C. tiliacea que presentaron mayor tamaño fueron aquellas cultivadas con 0 y 0,5 mg L^-1 BA, sugiriendo que las concentraciones endógenas de citocininas son adecuadas para la regeneración de brotes, o bien, que esta especie no requiere demasiadas citocininas para dicho proceso.

Por otro lado, Marulanda et al. ⁽¹³⁾ señalaron que el incremento de BA aumenta de manera significativa la producción de callo, lo cual se observó en este trabajo. Asimismo, indicaron que la formación de callos en el proceso de multiplicación no es deseable, por lo que es preferible emplear en el medio de cultivo la concentración menor de BA.

Las concentraciones 0 y 0,5 mg L^-1 BA permitieron la formación de raíces adventicias que crecieron más eficientemente en la parte media y apical del segmento nodal empleado, lo cual sugiere una posible presencia diferencial de hormonas endógenas en cada sección del explante. El medio sin BA pero con auxinas formó raíces ya que, como lo indican Latsague et al. ⁽⁹⁾, las auxinas favorecen la formación de raíces adventicias, debido a que modifican la extensibilidad celular, al producir factores que ablandan la pared. Por otro lado, se sabe que diversas concentraciones de citocininas suprimen la dominancia apical en las plantas, lo cual causa la brotación de las yemas laterales y la inhibición de la formación y crecimiento de las raíces ⁽⁸⁾, esto último logrado en C. tiliacea con la adición de 0,5 mg L^-1 BA.

En este trabajo, en la etapa de multiplicación (específicamente en los tratamientos sin hormonas) se regeneraron raíces adventicias; sin embargo, en la etapa de enraizamiento, el medio de cultivo adicionado con las auxinas ANA, AIB y AIA indujeron un mayor número de raíces, con respecto a la etapa de multiplicación.

Se ha indicado que las auxinas promueven la formación de las raíces laterales y adventicias, además de participar en la inhibición correlativa de las yemas axilares y brotes ⁽⁸⁾. Por su parte, Quintero et al. ⁽¹⁹⁾ indicaron que en Dioscoreas sp., al aumentar la concentración de ANA, el número de raíces fue mayor pero también se incrementó la formación de callo y la oxidación del medio de cultivo.

ANA indujo una mayor formación de raíces secundarias con respecto a las otras dos auxinas, sugiriendo una mayor sensibilidad de la célula a ANA para inducir este tipo de raíces. Por otro lado, AIB indujo una mayor elongación en la raíz principal. Parada y Villegas ⁽¹⁷⁾ reportaron mayor longitud de raíces en el híbrido "almendro (Prunus amygdalus Batsch). x durazno (Prunus persica L.) H1" con 0,1 μM AIB. En el caso de Cissus, nuevamente ANA indujo un mayor diámetro de raíz y, en general, una mejor respuesta a las variables evaluadas. Esto concuerda con lo reportado por Al-Maarri et al. ⁽¹⁾, quienes mencionaron que 0,2 mg L^-1 de ANA indujo la formación de raíces de buena calidad en Pyrus communis L., mientras que la menor formación de raíces fue con AIA.

Por otro lado, Quintero et al. ⁽¹⁹⁾ indicaron que al aumentar la concentración de ANA se obtuvieron raíces con mayor diámetro en Dioscoreas sp., de manera similar a lo observado con Cissus tiliacea. Parada y Villegas ⁽¹⁷⁾ indicaron que el tiempo de permanencia del explante en el medio de cultivo en la etapa de enraizamiento está en función del tamaño de raíz, además de que los explantes con estas características dan mayor oportunidad de sobrevivencia en la etapa de aclimatación.

CONCLUSIONES

En la presente investigación se logró la micropropagación de Cissus tiliacea, por lo que se considera un método efectivo para la propagación de este recurso ftogenético y con ello su potencial conservación. Sin embargo, se deben realizar nuevas investigaciones con la finalidad de obtener mejores resultados. El establecimiento in vitro es posible en cualquiera de los dos medios de cultivos evaluados: MS y WPM. Las concentraciones 0 y 0,5 mg L^-1 de BA fueron las dosis más adecuadas para el establecimiento y multiplicación in vitro, mientras que para la etapa de enraizamiento, la auxina ácido naftalén acético propició un mayor diámetro de la raíz principal y mayor número de raíces secundarias.

Agradecimientos

A la Universidad Autónoma del Estado de México por el financiamiento parcial del presente trabajo a través del proyecto 2486/2007 a cargo de Omar Franco-Mora.

A CONACYT-México por otorgar la beca para el estudio de Maestría de José Humberto Jiménez-Martínez.

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