ARTÍCULOS ORIGINALES

Respuestas fisiológicas a la suplementación con calcio de plántulas de vinal (Prosopis ruscifolia G.) estresadas con NaCl

 

Physiological responses to calcium supplementation of NaCl-stressed vinal (Prosopis ruscifolia G.) seedlings

Diego Ariel Meloni

Facultad de Agronomía y Agroindustrias. Universidad Nacional de Santiago del Estero. Av. Belgrano (S) 1912. (4200) Santiago del Estero. Argentina. dmeloni@unse.edu.ar

Originales: Recepción: 06/09/2011 - Aceptación: 07/08/2012

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RESUMEN

Vinal (Prosopis ruscifolia G.) es una especie de importancia forestal, nativa de la Región Fitogeográfica del Chaco Occidental, altamente tolerante al estrés salino. El objetivo de este trabajo fue poner a prueba la hipótesis de que la suplementación con CaSO₄ disminuye la concentración de iones tóxicos en plántulas de vinal, e incrementa la concentración de prolina, permitiendo un ajuste osmótico. Las plántulas se cultivaron en solución nutritiva de Hoagland al 25%, con o sin la adición de 0,4 mol L^-1 de NaCl, y con o sin suplementación de 5 ó 10 mmol L^-1 de CaSO₄. Se determinó la materia seca, composición mineral, contenido relativo de agua y concentraciones de prolina y azúcares solubles. Se utilizó un diseño experimental completamente aleatorizado con cinco repeticiones, y los resultados se analizaron con ANOVA y test de Tukey. Los resultados obtenidos en este trabajo confirman el rol protector del Ca⁺², a través de la manutención de las concentraciones de Ca⁺², K+ y Mg⁺² en los tejidos, la inhibición de la absorción de Na⁺ y el ajuste osmótico mediante la síntesis de solutos osmocompatibles.

Palabras clave: Prosopis ruscifolia; Nutrición mineral; Relaciones hídricas; Ajuste osmótico

SUMMARY

Vinal (Prosopis ruscifolia G.) is a highly-tolerant to saline stress species of forest-importance native to the Western Chaco Phytogeographical Region. The aim of this paper was to test the hypothesis that supplementing vinal seedlings with CaSO₄ lowers their concentration of toxic ions and increases proline concentration allowing for osmotic adjustment. The seedlings were cultivated in a 25% Hoagland solutions whether adding 0.4 mol L^-1 of NaCl or not, and whether supplementing it with 5 or 10 mmol L^-1 of CaSO₄ or not. Both dry matter, mineral composition, relative water content and proline and soluble sugar concentrations were determined. A totally randomized experimental design was used with five repetitions and the results analyzed with ANOVA and the Tukey test. The results obtained endorse the protecting role of Ca⁺² by maintaining Ca⁺², K+, and Mg⁺² concentrations in tissues; the Na⁺ absorption inhibition; and the osmotic adjustment by synthesizing osmocompatible solutes.

Keywords

Prosopis ruscifolia; Mineral nutrition; Water relations; Osmotic adjustment

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INTRODUCCIÓN

El aumento de la concentración salina en el suelo limita la producción vegetal en regiones áridas y semiáridas. El vinal (Prosopis ruscifolia G.) es una especie altamente tolerante al estrés salino, que presenta múltiples aplicaciones: madera, leña, forraje, etc. Por estas características es apto para la realización de plantaciones en zonas salinas, donde no pueden desarrollarse otras especies de importancia forestal ⁽¹⁸⁾.
Se ha demostrado que el umbral para su germinación es de 0,6 M de NaCl, y para el crecimiento de plántulas de 0,4 M ⁽⁹⁾. Su elevada tolerancia a la salinidad se basa en la realización de ajuste osmótico, la baja traslocación de Na⁺ a la parte aérea y un eficiente sistema de enzimas antioxidantes, que detoxifican los radicales libres producidos como consecuencia del estrés ^{(9, 18)}.
La adición de Ca⁺² ha mitigado la inhibición del crecimiento producido por el estrés salino en algunas especies ^{(16, 20, 21)}, mientras en otras no ha tenido un efecto significativo ^{(15, 19)}. Por el contrario, en C. quinoa y A. occidentalis la adición de CaSO₄ incrementó el efecto inhibitorio del NaCl sobre la germinación ⁽¹⁾.
Varios mecanismos pueden estar involucrados en la reversión del efecto inhibitorio del NaCl sobre el crecimiento, mediante la adición de Ca2⁺. En trigo (T. aestivum L. cv Punjab 85), Zaman et al. ⁽²¹⁾ observaron que este efecto estuvo asociado a un incremento en las concentraciones foliares de K⁺, y en el contenido relativo de agua. Esta mejora en las relaciones hídricas de la planta podría justificarse a través de la síntesis de solutos osmocompatibles ⁽¹⁸⁾, como la prolina, azúcares solubles, o glicinabetaína, aunque existen pocos trabajos que estudien la relación entre la suplementación con calcio y la concentración de dichos compuestos orgánicos.

Objetivo

. Poner a prueba la hipótesis de que la suplementación con CaSO₄ disminuye la concentración de iones tóxicos en plántulas de vinal, e incrementa la concentración de prolina, permitiendo un ajuste osmótico.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal y condiciones de crecimiento
El área de estudio se caracteriza por un clima semiárido estacional ⁽³⁾. En esta región, P. ruscifolia forma bosques secundarios (vinalares) que se distribuyen naturalmente en áreas relacionadas con los derrames de los ríos Dulce y Salado, y en los márgenes de salitrales.
Los frutos se cosecharon al azar dentro de un bosque P. ruscifolia desarrollado al margen de lagunas temporales, en la localidad de Maco (27°51'20" S; 64°13'27"W), Provincia de Santiago del Estero, Argentina. Las semillas se extrajeron manualmente y se escarificaron con ácido sulfúrico durante 10 minutos, luego se enjuagaron con agua corriente durante 30 minutos. La siembra se realizó empleando toallas de papel humedecidas con agua destilada, que se incubaron en cámara de crecimiento por un lapso de 15 días a 25°C y 12 horas de fotoperíodo.
Se seleccionaron plántulas de tamaño homogéneo, y se cultivaron hidropónicamente en invernáculo, en solución nutritiva de Hoagland al 25%, con o sin la adición de 0,4 mol L^-1 de NaCl, y con o sin suplementación de 5ó 10 mM de CaSO₄. En el tratamiento salino, el NaCl se adicionó gradualmente (50 mM cada 24 horas), hasta lograr la concentración final, para evitar un shock osmótico. Las pérdidas por transpiración se compensaron mediante el agregado de agua destilada, manteniendo constante el nivel de solución en los recipientes. El pH se ajustó a 5,5 mediante la adición de 100 mmol L_-1 de KOH o HCl. Las soluciones nutritivas se cambiaron cada 5 días.
Durante el período en que se desarrollaron los ensayos, la radiación fotosintéticamente activa osciló entre un mínimo de 120 µmol m^-2 s^-1 durante la puesta de sol, hasta 1600 µmol m^-2 ssup al medio día, y la temperatura media del aire y humedad relativa dentro del invernáculo fue de 28°C y 52%, respectivamente.

Producción de biomasa, contenido relativo de agua (CRA) y determinaciones químicas
Luego de 30 días de tratamiento, las plantas se extrajeron de la solución nutritiva, se lavaron con agua destilada y se llevaron a estufa de ventilación forzada, a 62°C hasta peso constante. En ese material se determinó materia seca y composición mineral. La concentración de Na⁺ y K⁺ se cuantificó mediante espectrofotometría de llama ⁽¹³⁾, Ca⁺² y Mg⁺² mediante espectrometría de absorción atómica ⁽¹⁷⁾ y Cl- por titulación con AgNO₃ ⁽¹⁷⁾. El contenido relativo de agua se determinó de acuerdo con el método de Hall et al. ⁽¹⁰⁾.
Las concentraciones de prolina y azúcares solubles se determinaron en material fresco. La prolina se cuantificó mediante la técnica de Bates et al. ⁽²⁾: se homogeneizó el material vegetal en mortero de porcelana, con 5 mL de ácido sulfosalicílico al 3%. Se filtró con papel Whatman N° 1 y se colocaron en tubos de ensayo alícuotas de 1,3 mL de extracto, a las que se le adicionaron 1,3 mL de ninhidrina ácida y 1,3 mL de ácido acético glacial. Se calentaron los tubos en baño María a 100°C, durante una hora y se enfriaron en baño de hielo. Se leyó absorbancia de los extractos en espectrofotómetro, a 520 nm y se calculó la concentración de prolina, con auxilio de una curva patrón. Los resultados se expresaron como µmol de prolina.g PS^-1.
Los azúcares solubles se determinaron mediante la técnica de Dubois ⁽⁶⁾. Para ello se homogeneizará 0,1 g de material vegetal en 15 ml de agua destilada, se filtrará con papel Whatman N° 1 y se ajustará el volumen a 50 mL en matraz aforado. Posteriormente se colocará en tubo de ensayo una alícuota de 0,5 ml del extracto y se le adicionarán 0,5 mL de fenol 5% y 2,5 mL de H₂SO₄ concentrado. Se hervirá en baño María durante 20 minutos y se leerá absorbancia en espectrofotómetro a 490 nm. La concentración de azúcares será calculada con auxilio de una curva patrón de glucosa y se expresará en mg de glucosa.g PS^-1.

Diseño experimental y análisis estadístico
Se utilizó un diseño completamente aleatorizado con cinco repeticiones, y los resultados se analizaron con ANOVA y test de Tukey.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La adición de 0,4 mol L^-1 de NaCl en la solución nutritiva no afectó el crecimiento de la parte aérea, pero inhibió el desarrollo del sistema radicular (figura 1). La suplementación con calcio incrementó la biomasa de hojas y raíces, aunque no se obtuvieron diferencias entre las concentraciones ensayadas.

Figura 1. Peso seco de hojas y raíces de plántulas de vinal, crecidas en solución nutritiva de Hoagland 25%, con o sin la adición de 0,4 mol L^-1 de NaCl, y con o sin suplementación de 5 (Ca1) o 10 mM de CaSO₄ (Ca2).
Figure 1. Dry weight of leaves and roots of vinal seedlings grown in 25% Hoagland solution, with or without adding 0.4 mol L^-1 of NaCl, and with or without supplementing 5 (Ca1) or 10 mM of CaSO(Ca₂).

El estrés salino produjo un aumento en las concentraciones de Na⁺ y Cl^- y una disminución en las de Ca⁺², K⁺ y Mg⁺², tanto en las raíces como en las hojas (tabla).

Tabla 1. Composición mineral en hojas y raíces de plántulas de vinal, crecidas en solución nutritiva de Hoagland 25%, con o sin la adición de 0,4 mol L^-1 de NaCl, y con o sin suplementación de 5 (Ca1) o 10 mM de CaSO₄ (Ca2).
Table 1. Mineral composition in leaves and roots of vinal seedlings grown in 25% Hoagland solution, with or without adding 0.4 mol L^-1 of NaCl, and with or without supplementing 5 (Ca1) or 10 mM of CaSO₄ (Ca2).

La suplementación con 5 y 10 mM de Ca⁺² disminuyó la concentración de Na+ en raíces y hojas de plantas crecidas en 0,4 M de NaCl, y no modificó los niveles de Cl^-. Por otra parte, los tratamientos con ambas concentraciones de Ca⁺² lograron incrementar las concentraciones de dicho catión en plantas sometidas a estrés salino, aunque no alcanzaron los valores observados en el testigo. Un efecto similar se observó con las concentraciones de K⁺ y Mg⁺².
La adición Ca⁺² en el ambiente radicular ha sido sugerida como un método para mejorar la tolerancia de las plantas al estrés salino ⁽⁷⁾. Bajo condiciones de elevada salinidad suele disminuir la relación calcio/sodio en el suelo, lo cual afecta las propiedades de las membranas celulares debido al desplazamiento del Ca⁺² asociado a las mismas por el Na⁺ y conduce a una alteración en su integridad y selectividad ⁽¹⁴⁾.
Esto estimula el incremento de las concentraciones de Na⁺ dentro de las células, que puede inhibir la actividad de algunas enzimas, produciendo alteraciones en el metabolismo, en la absorción de K⁺, y su partición en la planta, afectando la apertura estomática ⁽⁷⁾. En conjunto, estos cambios inhiben el crecimiento vegetal. La adición de Ca⁺² al ambiente radicular de plantas sometidas a estrés salino mantiene o mejora la absorción selectiva de potasio a altas concentraciones de sodio, lo que previene el efecto deletéreo de un exceso de Na^{+ (7)}.
Otro rol atribuido a la suplementación con Ca⁺² es su contribución al ajuste osmótico, incrementando la acumulación de solutos osmocompatibles ⁽⁸⁾. Coincidiendo con estos resultados, el estrés salino no afectó el contenido relativo de agua (CRA) de las hojas, pero produjo una reducción significativa en las raíces, la cual fue revertida por la adición de calcio (figura 2). No se observaron diferencias significativas entre ambas concentraciones de Ca⁺².

Figura 2. Contenido relativo de agua (CRA) de hojas y raíces de plántulas de vinal, crecidas en solución nutritiva de Hoagland 25%, con o sin la adición de 0,4 mol L^-1 de NaCl, y con o sin suplementación de 5 (Ca1) o 10 mM de CaSO₄ (Ca2).
Figure 2. Relative water content (CRA) in leaves and roots of vinal seedlings grown in 25% Hoagland solution, with or without adding 0.4 mol L^-1 of NaCl, and with or without supplementing 5 (Ca1) or 10 mM of CaSO₄ (Ca2).

El incremento en el CRA, producido por la suplementación con Ca⁺² en las plántulas sometidas a estrés salino, indica la existencia de algún mecanismo de ajuste osmótico, que permitió mantener el gradiente de potencial hídrico entre los tejidos y la solución nutritiva, con la concomitante absorción de agua.
En concordancia con este resultado, el estrés salino duplicó la concentración de prolina en hojas, y la suplementación con 5 y 10 mM de Ca⁺² incrementó su concentración en 310 y 360% con respecto al testigo, respectivamente (figura 3, pág. 85).

Figura 3. Concentración de prolina en hojas y raíces de plántulas de vinal, crecidas en solución nutritiva de Hoagland 25%, con o sin la adición de 0,4 mol L^-1 de NaCl, y con o sin suplementación de 5 (Ca1) o 10 mM de CaSO₄ (Ca2).
Figure 3. Proline concentration in leaves and roots of vinal seedlings grown in 25% Hoagland solution, with or without adding 0.4 mol L^-1 of NaCl, and with or without supplementing 5 (Ca1) or 10 mM of CaSO₄ (Ca2).

En raíces, la salinidad no afectó la concentración de este soluto osmocompatible, mientras que la adición de 5 y 10 mM de Ca⁺² incrementó los valores en 86 y 127% en relación con el testigo, respectivamente.
La prolina no sólo contribuye al ajuste osmótico a nivel celular sino que ha sido citada como un protector de enzimas y un estabilizador de estructuras de organelas y macromoléculas. También actúa como una reserva de energía y nitrógeno, para ser utilizada luego de la exposición a la salinidad ^{(4, 8)}.
Estos resultados coinciden con los obtenidos por Colmer et al. ⁽⁵⁾ quienes observaron aumentos significativos en las concentraciones foliares de prolina, luego de la adición de Ca2⁺, en plántulas de Sorghum bicolor estresadas con NaCl. Por otra parte, difieren con los de Lacerda et al. ⁽¹⁶⁾ y Viera Silva et al. ⁽²⁰⁾ que no detectaron cambios en las concentraciones de este soluto en plantas de Sorghum bicolor y Vigna unguiculata, respectivamente, sometidas a estrés salino, con suplementación de Ca⁺².
Por el contrario, Girija et al. ⁽⁸⁾ demostraron que el Ca⁺² inhibe la síntesis de prolina, induciendo su degradación, en plantas de Arachis hypogaea. También difieren con los resultados citados por Jaleel et al. ^{(11, 12)} que reportaron una disminución en la concentración de prolina, en hojas de Phyllanthus amarus y Dioscorea rotundata, en presencia de NaCl, y suplementación con calcio.
El estrés salino también incrementó la concentración de azúcares solubles, tanto en raíces como en hojas (figura 4).

Figura 4. Concentración de azúcares solubles en hojas y raíces de plántulas de vinal, crecidas en solución nutritiva de Hoagland 25%, con o sin la adición de 0,4 mol L^-1 de NaCl, y con o sin suplementación de 5 (Ca1) o 10 mM de CaSO₄ (Ca2).
Figure 4. Soluble sugars in leaves and roots of vinal seedlings grown in 25% Hoagland solution, with or without adding 0.4 mol L^-1 of NaCl, and with or without supplementing 5 (Ca1) or 10 mM of CaSO₄(Ca2).

La adición de Ca⁺² en ambas concentraciones incrementó el contenido de azúcares, lo que demuestra que este catión estimuló la síntesis de solutos osmocompatibles.
Resultados similares fueron citados por Jaleel et al. ^{(11, 12)} en Dioscorea rotundata; estos autores atribuyeron dicho incremento a un aumento en la actividad a-amilasa, que utiliza calcio como cofactor.

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en este trabajo confirman el rol protector del Ca⁺², a través de la manutención de las concentraciones de Ca⁺², K⁺ y Mg⁺² en los tejidos, la inhibición de la absorción de Na⁺ y el ajuste osmótico mediante la síntesis de solutos osmocompatibles.

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